李 莎，王 露，王 迎，陈 平

(湖南师范大学 生命科学学院，湖南 长沙 410081)

可逆蛋白质磷酸化是由特定蛋白激酶和磷酸酶调控[1-2]的蛋白质翻译后修饰(Post translational modification，PTM)方式之一，参与调节机体生命活动的全过程，如生长发育、增殖、凋亡及分化等[3-5]。在真核生物中有1/3的蛋白质与磷酸化修饰相关[6]，主要发生在丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基侧链的羟基上，且磷酸化丝氨酸(pSer)、磷酸化苏氨酸(pThr)、磷酸化酪氨酸(pTyr)的比例为1 800∶200∶1[7]。鉴于蛋白质磷酸化修饰的重要性，基于质谱的多种方法被用于蛋白质磷酸化修饰鉴定[8]。然而，磷酸化修饰丰度低、高动态性以及非磷酸化肽段的信号抑制等因素极大地限制了其质谱鉴定[9]。因此，针对质谱分析前磷酸化肽的分离纯化，是深入研究磷酸化蛋白质组学的必要条件。

本文综述了多种磷酸化肽段富集方法，包括固相金属离子亲和色谱法(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)[10-12]、金属氧化亲和色谱法(Metal oxide affinity chromatography，MOAC)[13-15]、亲水相互作用色谱法(Hydrophilic interaction chromatography，HILIC)、静电排斥亲水相互作用色谱法(Ectrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography，ERLIC)、化学衍生法[16]、强阳/阴离子交换色谱法(Strong cation/anion exchange chromatography，SCX/SAX)以及基质辅助激光解析电离(Matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI)靶盘富集法等(图1)。鉴于磷酸化蛋白质组的多样性和复杂性，以及不同方法对肽段的偏爱性差异，目前没有一种方法可以富集到所有磷酸化肽。因此多种分离富集方法相结合被用于磷酸化肽段分析，以提高磷酸化修饰鉴定效率。

图1 磷酸化肽段富集方法Fig.1 Enrichment method of phosphopeptide

1 色谱分离富集法

1.1 固相金属离子亲和色谱法

固相金属离子亲和色谱法(IMAC)这一概念首次由Porath等[17]提出，主要利用带正电荷的金属离子吸附带负电荷的磷酸基团。常用金属离子包括Fe3+、Ga3+[18]、Al3+、Zr4+[19]以及Ti4+[20]等。传统的IMAC材料制备条件苛刻，且耗时耗力。随着材料相关技术的发展和应用，IMAC材料也不断创新，制备技术趋于成熟。如Wang等[21]采用紫外光引发聚合法制备Zr4+-IMAC单体，该方法制备方便，耗时短，且Zr4+-IMAC单体易于再生，富集结果重现性好。基于该方法优化的微芯片样式Zr4+-IMAC单体不仅对磷酸化肽段具有较高的选择性，而且与基质辅助激光解吸电离质谱法(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)具有很好的兼容性。随后，Wang等[22]改变传统的IMAC材料制备方法，制备了一种无螯和配体的新型共价有机骨架-IMAC材料(TpPa-2-Ti4+)，对磷酸化肽段检出限可达4 fmol。随着科技的发展，具有超级特异性的新一代Ti4+-IMAC[23-26]相继被研发，与传统的Fe3+-IMAC相比，这类新型Ti4+-IMAC富集磷酸肽具有高特异性、高富集效率等特点[27]。IMAC的主要缺点是金属离子与具有酸性氨基酸的非磷酸肽会发生非特异性结合，且富集后含有大量生物试剂，因此质谱鉴定前需进行脱盐处理，在一定程度上会造成样品量损失，且该法易受pH值、柱基质、上样/洗脱步骤等影响。最近，Zhu等[28]报道了一种pH/甘草磷控制的Fe3+-IMAC富集法，通过选择合适的pH值与甘草磷组合，可有效洗脱单磷酸及多磷酸化肽段，与常用洗脱缓冲液相比，MALDI-TOF质谱检测中磷酸化肽段的信噪比可提高3～5倍，且磷酸化多肽的回收率显著提高。Piovesana等[29]以1 mol/L乙酸和0.4 mol/L柠檬酸钠为缓冲液，在pH 9.0条件下有效提高了磷酸化肽段的洗脱率。研究表明，50%乙腈、0.1%三氟乙酸可增强β-酪蛋白酶解后磷酸化肽段与Nb5+-IMAC的结合力[30]。

1.2 金属氧化亲和色谱法

MOAC主要利用树脂中金属原子对磷酸基氧的高亲和力而使磷酸肽得到富集。最常用的材料为TiO2，除此之外，ZrO2[31]、SiO2[32]等也可用于磷酸化肽段富集。Pinkse等[33]首次将TiO2用于蛋白质酶解后磷酸化肽段富集，进一步研究发现其适用于从复杂样本中富集磷酸化肽[34-35]。Sun等相继制备了2种用于高效吸附磷酸化肽和糖肽的磁性纳米材料，一种是亲水三肽包被磁性TiO2的多功能纳米复合材料Mag TiO2-GSH[36]，一种是巯基琥珀酸改性介孔TiO2包被Fe3O4的亲水性磁性纳米材料Fe3O4@mTiO2-MSA[37]。Zhu等[38]对传统TiO2进行改性，采用溶胶-凝胶法合成了一种具有更大比表面积的新型TiO2/Bi/Fe/Zr纳米材料，对磷酸化肽段的检出限可达4×10-10mol/L。Wang等[39]基于生物材料花粉(Pollen grains，PGs)表面积大、颗粒均匀等特性，合成了一种用于磷酸化肽富集的新型双金属氧化物MOAC复合材料(PGs@(Ti-Zr)O4)，该材料具有选择性高(β-酪蛋白-BSA=1∶1 500)、检出限低(0.1 fmol)等特点。随着材料科学的进步，掺杂磁性纳米颗粒的MOAC新型材料也不断向前发展，如聚酰亚胺-FexOy-ZrO2[31]、Fe3O4@PDA@MIL-125@Au@L-Cys[40]、Fe3O4@SiO2-磁性纳米颗粒[24]、Fe3O4@H-fTiO2[41]等纳米复合材料在磷酸化肽段富集方面表现出较高的富集效率。

MOAC富集效率易受富集体系中不同试剂成分、缓冲液pH值等的影响。因此，复杂生物样本中选择性富集磷酸化肽段成功与否的关键在于能否尽可能降低非磷酸化肽的干扰。对于富集条件的优化，如采用含乳酸[42]、邻苯二甲酸[43]的洗涤缓冲液，以及含磷酸铵[44]和吡咯烷[45]的洗脱缓冲液，或者是在富集体系中添加2,5-二羟基苯甲酸[46]等，均可改善TiO2的非特异性吸附问题。Fukuda等[47]采用甘油添加剂同时联合NH4OH和双丙烷洗脱缓冲液，提高了TiO2对单磷酸化肽的选择性富集效率，在PC3细胞中鉴定出8 300个磷酸化位点，对应2 600个磷酸化蛋白。Klement等[48]发现离子浓度较低的洗脱缓冲液可有效抑制非磷酸化肽段的吸附，从而洗脱出较多的磷酸化肽段。

比较MOAC和IMAC在内的各种磷酸化肽富集方法产生的磷酸化数据库，可发现目前还没有一种磷酸化肽富集方法能够完全覆盖整个磷酸化蛋白质组。克服这种方法偏差的策略是结合多种富集技术来提高磷酸化蛋白质组的覆盖范围。

1.3 SCX/SAX富集法

鉴于组织样本的复杂性，直接进行磷酸化修饰分析充满挑战，因此有必要对磷酸化多肽进行分离富集。SCX[49-50]分离富集原理是使带负电的磷酸化肽段流过带负电官能团的固定相时，由于静电排斥作用，较早的被洗脱出来。而SAX与SCX作用机制相反，磷酸肽可较强的吸附在阳离子固定相中。

SCX是目前常用的高效液相色谱分离方法之一，在磷酸化蛋白质组学中也有应用。在酸性pH值中，胰酶酶解的肽段大多数带电荷量为+2，而磷酸化肽段由于含有一个带负电荷的磷酸基团，从而使其带电荷为+1，尤其是多磷酸位点的肽段会在SCX的早期分馏物中被洗脱出来[50]。

带负电荷的磷酸化肽比非磷酸化肽具有更强的酸性，更适合用SAX[51]分离富集。研究表明，SCX主要是吸附一些高亲水性的以及一些碱性磷酸化肽(pI>8.0)，而SAX吸附的磷酸化肽段pI为2.91～6.45，其中有少部分为强酸性磷酸化肽段(pI<3.0),同时，一些强酸性的非磷酸化肽会与磷酸化肽一起被洗脱[49]。若胰酶酶解不充分也会产生一些内源性精氨酸与赖氨酸，从而造成磷酸化肽带电荷量>1，不与磷酸化肽一起洗脱。基于SCX/SAX分离富集磷酸化肽的特点，Dehghani等[52]将SCX/SAX用于Hela细胞裂解物磷酸化肽段的富集，其中SCX法鉴定出9 812个磷酸化位点，对应3 674个磷酸化蛋白，而SAX鉴定出3 950个磷酸化位点，对应2 392个磷酸化蛋白。

1.4 其它色谱富集法

近年来，HILIC因可以避免质谱鉴定前脱盐等过程造成的样品损失，与质谱仪具有良好的兼容性[53]，被越来越多的作为SCX/SAX的替代方法[45,54]。然而，相关研究表明，HILIC对多磷酸化肽的分辨率要低于单磷酸化肽[55]。

ERLIC可与其它分离富集技术相结合应用于磷酸化蛋白质组学研究[56-57]，其分离富集磷酸化肽基本原理是:在离子交换色谱中，流动相为有机溶剂(如70%乙腈)，带负电荷的磷酸基团会与色谱填料柱发生静电相互作用，而流动相中的有机溶剂会增强磷酸化肽段的亲水相互作用，从而将磷酸化肽段与非磷酸化肽段分离。ERLIC对复杂样本中磷酸化肽段以及N-糖肽的成功分离富集，引起了学者们对于LC-MS鉴定前磷酸化肽段预分离技术的关注[58]。如Loroch等[59]将高灵敏度的ERLIC-SCX/RPLC-MS法用于微克级的Hela细胞磷酸化蛋白质组学鉴定；Hao等[60]将ERLIC与RPLC-MS/MS相结合，应用于大鼠肾脏磷酸化蛋白质组学研究，在近3 000个蛋白质中鉴定出583个磷酸化位点。

2 化学衍生法

β-消除反应原理是两个相邻碳原子上分别消除一个原子或原子团，生成一个不饱和键的过程。1986年，Meyer等[61]首次将β-消除/迈克加成反应用于cAMP底物Kemptide蛋白磷酸化丝氨酸修饰的鉴定。β-消除/迈克加成反应作为一种磷酸化修饰分析新策略，利用亲核取代防止磷酸基团的中性损失，克服了现存磷酸化富集方法的局限性[62]。Chen等[63]在β-消除/迈克加成反应过程中，引入硫代胆碱，将带负电荷的磷酸肽转换为带正电荷的四元季铵盐，使电喷雾离子源质谱(检出限低于500 amol/L检)电离效率增加了100倍。进一步研究表明，以胍二硝基乙硫醇[64]和三甲胺半胱胺盐酸盐[63]为加成试剂，均可优化质谱鉴定结果。当磷酸化苏氨酸位置接近脯氨酸时，采用2-氨基乙烷硫醇或者其它硫醇迈克加成试剂，可有效转化磷酸化肽段，提高富集效率并减少样品量损失[65-66]。

然而，β-消除/迈克加成反应也存在缺点。首先，该方法涉及多步反应，副产物多以及反应不完全现象会增加样品的复杂性；其次，亲和反应添加的Cα不具有立体专一性，会导致非对映体混合物的形成[67]，从而会影响质谱对磷酸化肽的鉴定效率。为解决这些问题，研究者通过引入二硫化基或碱基等不稳定基团提高磷酸化肽的富集效率[16]。如Nika等[65]通过在Michael受体反应体系中添加EDTA达到抑制副反应产生的目的。

3 MALDI靶盘富集法

常规磷酸化肽富集方法均是在溶液中完成，富集过程涉及离心、脱盐等繁琐步骤，易导致样品丢失，限制了其在微量磷酸化肽检测中的应用。

为了减少样品损失并对微量样品进行鉴定，可通过化学修饰MALDI靶盘实现对磷酸化肽段的原位富集，之后直接进行质谱分析[68]。这种MALDI靶盘原位富集法所需样品量少，在减少样品量损失的同时，实现了对低丰度磷酸化肽段的鉴定。最近研究表明，尽管TiO2或Ti4+-PDA修饰MALDI靶盘[68-69]富集过程耗时短，样品损失量少，但在溶剂蒸发期间由于纳米颗粒电离与聚集的不稳定性，会造成TiO2形态以及厚度难以控制，印刷、喷涂、煅烧等过程也会导致TiO2损失，此外MALDI靶盘昂贵的价格也限制了此类方法的应用。为了克服这些问题，已有报道采用铝箔[70]、载玻片[71-72]来替代商业化MALDI盘。如Lin等[68]采用原子层沉积(Atomic layer deposition，ALD)法将NH2修饰的TiO2共价偶联到MALDI靶盘，同时实现了TiO2形态和厚度的有效控制及磷酸化肽的富集；Wang等[73]采用脉冲激光淀积(Pulse layer deposition，PLD)法将多孔TiO2纳米颗粒偶联到MALDI靶盘上，并在TiO2表面修饰十八烷基三氯硅烷(Octadecyl trichlorosilane，OTS)，极大地提高了磷酸化肽段鉴定的稳定性和重现性。Chen等[74]将聚二甲硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)偶联到MALDI靶盘，增强了样本的灵敏度和均一性，使得鉴定到的多肽信号比未修饰的MALDI靶盘增强了7.1～11倍。随后，该课题组[75]在此基础上，将PDMS偶联的MALDI靶盘与TiO2结合，这种二氧化钛-聚二甲硅氧烷MALDI靶盘(TP)具有样品重复性良好、样品损失率低以及样本兼容性高等特点，在磷酸化蛋白质组学中具有很好的应用前景。

4 多种方法结合

4.1 多维色谱技术

单独采用某方法时，获得的磷酸化蛋白质组学数据是有限的。研究表明，将SAX、SCX、HILIC、ERLIC与反相液相色谱法(Reversed phase liquid chromatography，RPLC)相结合，可以显著降低样品的复杂程度，从而增加磷酸化肽段的有效浓度[59]。因此多种技术串联富集磷酸化肽的方法逐渐受到重视。

可根据磷酸化肽段疏水性、带电荷状态及亲水性对分离富集方法进行优化，多种色谱方法相结合可解决不同理化性质磷酸化肽段分离富集方面所存在的问题，SCX-RPLC-MS/MS是大规模磷酸化蛋白质组学研究中最常用的分离富集技术[76]。

Link等[77]首次采用多维色谱分离技术SCX-RPLC分析磷酸化蛋白质组，此外，SCX/SAX多维反相液相色谱可以有效保留磷酸化肽，增加嗜碱性和嗜酸性激酶底物中阴离子和阳离子磷酸化肽的覆盖范围[49]。

在磷酸化蛋白质组学研究中，磷酸化肽段含量低，质谱检测灵敏度差等特点，使得实验所需样本一般需达到毫克级别。为克服这些局限性，Loroch等[59]采用结合SCX的多维质谱鉴定技术(ERLIC-SCX/RPLC-MS)从100 mg Hela细胞酶解物中鉴定出7 500多个磷酸化位点，对应3 013个磷酸化蛋白。与MOAC-Ti4+富集法相比，ERLIC-SCX/RPLC-MS可富集到较长的酸性磷酸肽，在大规模磷酸化蛋白质组学中有良好的应用前景。随后，该课题组[78]又将二维ERLIC-SCX/RPLC-MS磷酸化肽段富集方法细化为覆盖全局蛋白质组学的3-D工作流，并成功用于小鼠巨噬细胞病毒感染小鼠成纤维细胞的磷酸化蛋白质组学研究中。与2-D富集技术相比，3-D工作流具有样品半自动化处理潜力，在临床和生物医学研究中具有良好的应用前景。

4.2 多维色谱与MOAC/IMAC法相结合

目前磷酸化蛋白质组学研究中，SCX与IMAC方法相结合得到了广泛应用[79]。然而SCX-IMAC分离富集磷酸化肽过程中，酶解、冻干、脱盐等繁琐流程易导致样品损失。Yue等[80]通过优化SCX-IMAC方法，采用multi-IMAC-HLB从3 mg样本中鉴定出8 969个磷酸化肽段，而SCX-IMAC从15 mg样品中仅鉴定出5 519个磷酸化肽段。Carrera等[50]开发了一种用于生成大规模磷蛋白组学数据集(<15 h)的快速分析方法，即HIFU-TiO2-SCX-LC-MS/MS，克服了以往SCX-IMAC分离富集过程耗时耗力的缺陷。

在多维色谱分离系统中，HILIC是最理想的一维分离系统。如Zappacosta等[81]根据磷酸基团的亲水性以及磷酸化肽段在亲水相中的保留度，将HILIC作为IMAC的预分离技术从而降低样品复杂性，从500 mg大鼠肝脏样品中富集鉴定出16 000个磷酸化位点。SIMAC(Sequential elution from IMAC)是一种高通量磷酸化蛋白质组学研究方法，可从多磷酸化肽中分离出单磷酸化肽，提高复杂样品中多磷酸化肽的鉴定数量[82]。此外，SIMAC、HILIC与TiO2多种技术相结合可用于微克级胰岛素瘤细胞裂解物全局磷酸化肽段的鉴定[83]。

酪氨酸由于磷酸化水平较低，常规富集方法对磷酸化酪氨酸无特异性，因此需要基于抗体开发的方法才可达到对磷酸化酪氨酸的选择性富集[84]。如Abe等[85]通过优化常规磷酸化酪氨酸富集方法，采用磷酸化酪氨酸抗体免疫沉淀法(pY-IP)与Fe3+-IMAC两步富集磷酸化酪氨酸，从8 mg PC3细胞裂解物中鉴定出1 000多个酪氨酸磷酸化位点，这种磷酸化酪氨酸蛋白质组学方法具有揭示未知pY信号模式和识别新型激酶抗癌靶点的潜力。基于抗体开发的磷酸化酪氨酸富集法不断创新，Iliuk等[86]开发出的一种高灵敏度的新型蛋白质组学研究工具即基于聚合物的金属离子亲和捕获(PolyMAC)-抗体组合型方法，在酪氨酸磷酸化所参与的信号通路研究中具有良好的应用前景。

然而，多种方法相结合富集磷酸肽的过程不仅费时费力，也会造成低丰度磷酸化肽损失。为避免这些方法在磷酸化肽段富集方面存在的偏差，需开发一种不同富集技术结合的新型杂合材料，简化操作流程。基于MOAC与IMAC对磷酸化肽段偏爱性不同的特点，Yang等[87]设计开发了一种多功能纳米材料Fe3O4@nSiO2@mSiO2/TiO2-Ti4+，该材料具有较高的比表面积(179.3 m2/g)和吸收性能(133 mg/g)，质谱检测灵敏度可达4 pmol。Wang等[88]制备了一种吡啶醛5′-磷酸盐介导的固定化金属亲和材料即Fe3O4@SiO2-PLP-Ti4+，减少了非磷酸化肽的非特异性吸附，促进了磷酸化肽段的选择性吸附。

5 展 望

在磷酸化蛋白质组学中，优化磷酸化肽段分离富集方法并不是提高磷酸化蛋白质鉴定效率的唯一选择。有研究报道质谱可提高磷酸化蛋白质组学鉴定效率[6,89]，但在质谱鉴定前生物样本的动态变化导致样品变得复杂。因此，磷酸化蛋白质组学研究重点之一是开发高选择性的样品制备工具，用以富集磷酸化肽和蛋白质。

随着磷酸化蛋白质组学的不断发展，对于磷酸化肽段的分离纯化技术要求也不断增长。样品浓缩技术必须朝着避免目标产物损失，减少干扰分子非特异性富集方向发展。如本文所提到的一些分离富集方法对于减少非特异性磷酸化肽段的非特异性结合具有良好的效果。

现如今由于质谱仪检测范围有限，在浓度较低的磷酸化肽段检测方面经常受到阻碍。因此，未来磷酸化蛋白质组学研究必须致力于提高质谱检测灵敏度，以便能追踪到与疾病相关的一些含量较低的磷酸化蛋白质，这也意味着需研究开发高灵敏度的样品制备方法，用于富集丰度较低的目标分子。