匡春俊 董 婷 周 萍 李秀英 田丽伟 黄 鹏

1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院脑病中心，安徽 合肥230031

Wilson病(Wilson’s disease,WD)，即肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration,HLD)，是ATP7B基因缺陷引起的铜代谢障碍疾病。患者因基因缺陷不能清除体内多余的铜，使铜离子沉积于脑部、肝脏、肾脏、皮肤、眼部等脏器系统，使各组织脏器铜中毒受损而出现多样的临床表现。铜作为强氧化剂，可激活自由基，促进ROS的产生[1]，诱发氧化应激反应，使神经细胞凋亡。铜沉积脑部，神经系统受损，出现进行性智力减退[2-3]、精神异常等症状。在祖国医学研究中，将WD以认知能力下降为主要临床表现的辨病为“痴呆病”，其中“痰瘀互结型”易出现认知障碍。安徽中医药大学第一附属医院脑病中心为WD患者研制的肝豆灵(Gan dou liang,GDL)具有化痰祛瘀作用，课题组前期研究发现肝豆灵能够明显改善WD患者认知障碍[4]，提高患者智力水平。课题组在WD病程研究过程中发现，NSC是高铜负荷的重要靶点，肝豆灵能抵抗高铜导致的NSC生长阻碍，从而发挥神经保护作用[5]。因此，本研究从动物、分子水平，利用课题组前期体外建立的高铜培养NSC模型[6]，予以药物“肝豆灵”干预，观察胎鼠海马组织NSC中ROS水平的高低，为探讨肝豆灵对高铜诱导的NSC损伤小鼠的神经保护作用及其分子机制提供研究基础。

1 实验材料

1.1 动物 体重200～220 g SD大鼠75只，SPF级，由安徽动物中心提供，许可证号为SCXK(皖)2014-002。大鼠于专用清洁实验室饲养1周，温度25℃，相对湿度50%～70%，模拟自然昼夜循环光照的非直射光线。孕14 d ICR小鼠3只，适应性喂养后取胚胎海马组织，分离并培养NSC。

1.2 分组 SD大鼠随机分组为对照组，模型组，肝豆灵处理高、中、低剂量组，用药剂量根据成人每日使用剂量按照体表面积换算法换算，0.2 mL/10g体重灌胃，每日1次。对照组、模型组以等体积生理盐水灌胃，两组均连续给药7 d。肝豆灵剂量0.0075 g/10g体重，每0.3 g溶于8 mL溶液，低剂量组为0.48 g/(kg·d)，中剂量组为0.96 g/(kg·d)，高剂量组为1.92 g/(kg·d)。

1.3 实验材料、仪器与试剂 显微剪、显微镊、45度显微剪、线栓、普通刀柄、手术刀片、组织冲洗球，均由上海金粒器械公司提供；空调，海尔公司；湿度计，上海生工；纯水机，Millipore公司；T臂迷宫，友诚生物科技有限公司。胰蛋白酶、DMEM/F12 (1：1)液体培养基，HyClone 公司；胎牛血清、无血清培养添加剂N2，Gibco；重组人表皮生长因子，Peprotech；重组人碱性成纤维细胞生长因子，Peprotech；噻唑蓝，Amresco；二甲基亚砜，Sigma；ROS检测试剂盒，ThermoScientific；Trizol试剂，Invitrogen；核蛋白提取试剂盒，Sigma公司，DU800紫外可见分光光度计，美国贝克曼；细胞培养箱2306-2，美国Shellab；倒置显微镜DMLL，德国徕卡；Odyssey双色红外荧光成像系统，美国LI-COR。

1.4 药物 肝豆灵片。安徽中医药大学第一附属医院研制，0.3 g/片，150片/盒，批号20150522。由石菖蒲、丹参、姜黄、莪术、郁金、黄连、大黄、金钱草等组成。

2 实验方法

2.1 行为学观察

2.1.1 原理 在动物心理学的实验研究中，迷宫是常用的一种仪器，迷宫任务具有明显的空间特征。在记忆类研究中，常用的是放射迷宫。T迷宫是依靠觅食动机诱导动物完成任务的一种迷宫实验，实验操作将大鼠放入迷宫的中央区域，然后在每个臂尽头的小洞放一小块食物，允许大鼠探究迷宫直到它收集到所有食物。适应迷宫后，在两条目标臂中随机选择一条臂末端放入食饵，关闭另一条臂。将动物放入起始箱，使其进入目标臂获取食饵，连续训练一段时间后进入正式实验。先是强迫训练，选择一条臂开放并放入食饵，另一条臂关闭，当动物进入有食饵的臂获得奖励后，将其马上放回主干臂，而后让其自由探索左右两臂，动物若进入无食饵的臂，记为一次“错误次数”，反之为“正确次数”，重复测试多次。统计总的正确率越高，潜伏期越短，表明动物工作记忆越好[7]。完成此任务大鼠需要依靠参照记忆、工作记忆[8]学会任务的规则。

2.1.2 方法 将大鼠放入起始箱，封闭闸门。打开闸门，大鼠进入主干臂，关掉一侧目标臂，强迫大鼠进入另一侧开放臂，成功奖励2粒食丸，5 s内把大鼠放回主干臂，进行二次训练。开放两个目标臂，大鼠把两前肢和至少两后肢一只放于一个目标臂，则算作完成“一次选择”。大鼠折返回训练时进入过的臂则获得奖赏4粒食丸，记录一次正确选择，进入另一臂，没有奖赏，且将其限制在该臂内10 s，记录一次错误选择。训练结束后，将大鼠放回笼内5～10 min(同时试验其他大鼠)，重复训练，每天8次。连续两天正确选择达15/16，开始试验。30 d后不达标，则淘汰。记录大鼠进入电刺激区的时间(s)。

2.2 NSC分离、培养，ROS检测 无菌条件下取孕14d ICR小鼠胚胎海马组织，以胰蛋白酶解消化，放入含有0.7 mg/mL卵蛋白的DMEM/F12(1∶1)，机械吹散。在低温条件下于2000 r/min离心细胞悬液5 min，后洗涤沉淀；重悬细胞，浓度5000～10000/mL，予以悬浮培养。存活细胞予免疫细胞化学检查，以验证其是否都为Abcg2+的NSC。体外培养的NSC模型分为对照组、高铜模型组和高、中、低剂量肝豆灵片处理组。对照组在DMEM中加入10%的SD大鼠空白血清，模型组用含10%的SD大鼠空白血清铜负荷培养基(200μmol/L工作浓度)予以培养；肝豆灵低、中、高剂量组予以3种不同剂量配制的10%的肝豆灵药物血清铜负荷培养基培养。运用CellROXTM Deep Red Flow Cytometry AssayKit分离、收集、流式分选Agcg2+的NSC。5×105个/mL为各试验组检测用细胞浓度。将CellROX Deep Red reagent(终浓度为500～1000 nmol/L)加入至样本中，于37℃的条件下避光孵育30～60 min。于孵育末15 min内，在每1 mL样本中加1 mmol/L SYTOX Blue Dead CellStain solution 1 μL，进行流式分析。于激发光波长405 nm处检测SYTOX Blue Dead Cell Stain，于635 nm处检测Cell ROX Deep Red reagent，并分别于450/50BP和665/40BP的滤光片处收集荧光发射光。

3 统计学方法

4 结果

4.1 行为学结果 造模前，各组进入电刺激区的时间(s)差异无统计学意义(P>0.05)。治疗7 d后，模型组和小剂量治疗组的进入电刺激区的时间(s)明显增加，经过药物治疗后，中、高剂量组进入电刺激区的时间(s)明显降低。结果见图1，表1。

组别鼠数剂量/g/(kg·d)造模前治疗7d空白对照组1514.37±2.8214.93±3.23模型组1515.42±2.8228.90±5.29△低剂量组150.4815.56±3.1830.54±5.72△中剂量组150.9616.12±4.4124.55±3.74△∗高剂量组151.9215.07±4.4118.23±3.51#

注：与造模前比较，△P<0.01；与对照组比较，△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，#P<0.01。

4.2 NSC中ROS水平检测结果 模型组高于对照组(P<0.01)，肝豆灵组高于对照组(P<0.05)，低于模型组(P<0.05)。结果可见图2，表2。

组别鼠数剂量/g/(kg·d)ROS空白对照组3100.0±0.0模型组3284.2±12.3∗低剂量组30.48279.9±13.9∗中剂量组30.96209.8±9.7∗高剂量组31.92136.9±4.5

注：与空白对照组比较，*P<0.01，模型组与肝豆灵组比较，*P<0.05。

5 小结

WD是基因缺陷引起的铜代谢障碍性疾病，铜离子沉积脑部过多产生神经毒性，使神经细胞受损凋亡，发为WD。铜在脑部沉积以壳核最为显著[9]。方向等[10]发现铜负荷大鼠学习定位能力下降，存在明显的学习记忆障碍。韩辉等[5]发现，高铜可降低小鼠海马神经干细胞数目。在ATP7B基因缺陷小鼠中，研究人员发现肝脏和脑部的呼吸链复合物I活性增加，而复合物II，III和IV活性则减弱。其中，呼吸链复合物I是线粒体产生ROS的主要来源[11]。铜离子促进细胞内ROS产生，诱发氧化应激反应，从而导致细胞死亡。Altman等[12]证实大脑具有神经再生能力，脑组织中存在着的NSC[13]，可很长时间保持静止状态，在大脑受到损伤时NSC会大量增生并向受损区域转移替代，而ROS是调控神经细胞数量的重要因素[14]。

WD的临床表现主要有精神障碍、认知下降、言语含糊、口涎不止、肝脾肿大、腹部水胀、肢体扭转、震颤等，祖国医学根据这些症状特点将WD归于“肝风”“积聚”“水肿”“痉病”“癫痫”“痴呆”“癫狂”“黄疸”“鼓胀”“癥瘕”“震颤”“瘈疭”等范畴。在发病机制认识方面，中医认为，肝豆状核变性系先天禀赋不足，或先天脾胃失养，或情志所伤，肝郁脾虚，或外感邪毒，铜毒内积，湿热蕴生，痰瘀相结，癥积成形。杨文明等[15]认为“铜毒”是WD发展过程中独特的病理基础，决定其发展方向。韩辉等[16]研究得出，WD发病前的证型为肝气郁结证、湿热内蕴证、痰瘀互结证、脾肾阳虚证、肝肾阴虚证。其中认知障碍易出现于痰瘀互结型。我院脑病中心研制的院内制剂肝豆灵片，由石菖蒲、郁金、丹参、姜黄、莪术、鸡血藤、黄连、大黄组成。有利胆排铜、清热解毒、化瘀软坚之效，石菖蒲开窍豁痰、醒神益智；黄连清热泻火解毒；郁金可利胆退黄、清心凉血；大黄，清热泻下，解毒利湿；姜黄、莪术与鸡血藤，活血行气；丹参活血祛瘀、清心除烦。王艳昕等[17]发现肝豆灵可减少海马神经细胞凋亡，保护脑神经。现代药理研究发现，石菖蒲可抑制神经细胞凋亡[18]，保护脑神经。丹参提取物丹参酮ⅡA可减少caspase-3得表达实现其抗凋亡的机能，而保护神经细胞[19]。大黄可清除离体大鼠脑中的超氧自由基，抑制超氧化物歧化酶的生成，改善学习记忆功能。鸡血藤可提升脑组织ATP酶活性，改善脑细胞代谢障碍[20]。黄连可提高机体抗氧化能力[21]，降低ROS，保护神经细胞。郁金、莪术、姜黄的提取物姜黄素也有抗氧化效应[22]。实验结果提示，铜负荷使小鼠NSC中ROS水平明显上升，大鼠进入电刺激区的时间明显上升，经肝豆灵干预后，中、高剂量组小鼠NSC中ROS水平明显下降，大鼠进入电刺激区时间明显减少。可推测，不同剂量的肝豆灵可通过降低NSC中的ROS水平，对NSC高铜负荷模型有一定的修复作用。董婷[4]认为，肝豆灵是干扰了NSC中Nrf2的水平，降低了ROS，进一步阐述了肝豆灵作用于NSC的作用机制。