周治国 厉彩霞

姜黄素是从植物姜黄等的根茎中分离提取出来的一种原生态多元酚类物质［1］。被广泛用于癌症、哮喘、糖尿病和中枢神经系统退行性疾病等慢性疾病的治疗［2］。大量研究表明姜黄素通过调控各种相关的靶标分子，包括促炎因子、生长因子、细胞增殖和凋亡相关因子、粘附因子和转录因子，从而在多种细胞中发挥调节作用［3］。肺泡巨噬细胞作为肺脏的主要炎症细胞，是机体肺部抵御病原体侵入和肺损伤的重要屏障，在各种肺脏疾病中发挥关键作用。脂多糖（LPS）刺激常作为各种体内外炎症模型，能够诱导巨噬细胞分泌大量细胞因子。姜黄素对LPS 刺激的肺泡巨噬细胞中炎症损伤的调节作用相关报道较少，本文探讨姜黄素调节LPS 损伤的大鼠巨噬细胞炎症反应的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）仪器：普通光学显微镜（奥林巴斯公司，型号CKX31）；生物安全柜、高速冷冻离心机和CO2培养箱（均为Thermo 公司，型号分别为1300-A2和ST-16R 和SERIES II）；水平低速常温离心机（湘仪公司，型号L-500）；电热恒温鼓风干燥箱（精宏公司，型号DHG-9140A）；酶标仪（美国Biotek 公司，型号Epoch）；电泳槽（BIO-RAD 公司，型号165-8004）；PVDF 膜（Millipore 公司，型号IPVH00010）。（2）试剂：胎牛血清、1640 培养基、Penicillin-Streptomycin 和胰蛋白酶均购于Gibco 公司（型号分别为10099-141、11875500BT、15140-122、25200-072）；pro-IL-1β、IL-1β 和IL-18ELISA 检测试剂盒均购于酶联生物（型号分别为ml027415、ml003057、ml002816）；PBS（上海亿凡生物，型号YF3015）；NaCl（国药集团，型号10019360）；LPS（上海源叶生物，型号S11060）；姜黄素（鼓臣试剂，型号GCB2141）；瑞氏-吉姆萨染色试剂盒（南京建成，型号D010）；BCA 测蛋白试剂盒（Thermo 公司，型号PL212989RIPA）；细胞裂解液和PMSF 来自于碧云天公司（型号分别为P0013B和ST506）；兔多抗ASC 和NLRP3 购于Affinity 公司（型号分别为DF6304 和DF7438）；兔多抗Caspase1、HO-1 和iNOS 购 于Proteintech 公 司（型 号 分 别 为22915-1-AP、10701-1-AP 和18985-1-AP）；β-actin鼠单抗、anti-rabbit lgG-HRP 和M-lgG-kappa-BP-HRP购于Santa Cruz 公司（型号分别为Sc-130065、Sc-2357 和Sc-516142）。（3）实验动物：成年雄性SD 大鼠从上海斯莱克实验动物有限公司购买。

1.2 方法 （1）原代大鼠肺泡巨噬细胞的培养：成年雄性SD 大鼠经麻醉（乌拉坦）、固定、消毒、体外分离气管并经预冷的无菌PBS（含0.02%EDTA）灌肺（离体灌），反复灌抽 4 次。经离心去上清液，底部的细胞团用D-Hanks 溶液重悬。再次离心并去除上清液后，细胞团沉淀加入无菌双蒸水（9ml）破红10s，并加入9%的NaCl（1ml）恢复等渗。再次离心，将获得的细胞接种于10%胎牛血清RPMI 1640 培养基中，放在37℃，5%CO2培养箱中恒温。采用差速贴壁法分离肺泡巨噬细胞，2h 后吸掉上清液及未贴壁的细胞，剩下的即为巨噬细胞。（2）细胞纯度鉴定：肺泡巨噬细胞培养2d 后，吸出5μl 细胞悬液于载玻片上，晾干，先滴加试剂一染色1min 左右，并直接滴加试剂二，充分混匀染料后混合染色5min 左右。待干后进行镜检，细胞纯度（%）=染色的巨噬细胞数/总的细胞数×100%。（3）细胞药物处理分组：分为CON 组（空白组：只加PBS）、LPS 组（LPS+PBS）和LPS+J 组（LPS+姜黄素）（每组3 个平行）。将细胞浓度调整到1×106个/ml，接种于20%血清RPMI 1640 培养基的24 孔培养板中，CON 组不加任何处理；LPS 组每孔加入LPS 工作液（100ng/ml），LPS+J 组每孔加入LPS（100ng/ml）和姜黄素（15μmol/L）细胞处理24h。（4）ELISA 检测：经过处理后的细胞，在特定的时间内依据ELISA检测试剂盒使用说明书的具体步骤检测细胞上清液中pro-IL-1β、IL-lβ 和IL-18 含量变化。（5）Western blot：收集处理后的原代大鼠巨噬细胞，刮提蛋白并进行定量。定量的（25μg）蛋白加入至12%SDS-PAGE凝胶电泳中电泳分离。分离后的蛋白经转膜（湿转法），封闭（5%脱脂牛奶，2h），并加入对应的稀释后的一抗，（ASC，1 ∶500；NLRP3，1 ∶500；Caspase1，1 ∶500；HO-1，1 ∶1000；iNOS，1 ∶500；β-actin，1 ∶1000），4℃孵育整晚。第2 天洗膜后孵育二抗，（兔抗，1 ∶10000；鼠抗，1 ∶5000），37℃孵育2h。最后进行显影并结果处理。

1.3 统计学方法 采用SPSS 统计学软件分析。ELISA检测结果标曲采用二次项曲线形式表达（采用酶标仪配套Gen5 软件和Curve Expert 1.4 软件进行标曲数据处理）。Western blot 结果使用Image J 软件进行灰度分析。计量资料以（±s）表示，两组间比较用t 检验；多组间比较用方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代大鼠肺泡巨噬细胞形态和纯度鉴定 通过显微镜观察发现，原代大鼠肺泡巨噬细胞大小不均一，具有各种不同的形态，如圆形、扁圆形或不规则形，见图1A。细胞用瑞氏-姬姆萨染液染色后，纯度达到94%，见图1B。

图1 原代大鼠肺泡巨噬细胞形态和纯度鉴定

2.2 LPS 对HO-1 和iNOS 蛋白表达的影响 为验证LPS 造模是否成功，Western blot 检测HO-1 和iNOS在CON 组和LPS 组中的含量变化。与CON 组比较，HO-1 和iNOS 蛋白在LPS 处理组中的表达上调（P＜0.05）。见图2。

图2 大鼠巨噬细胞中HO-1和iNOS蛋白表达的变化

2.3 大鼠巨噬细胞中pro-IL-1β、IL-1β 和IL-18 的含量变化 与CON 组比较，LPS 作用于细胞后，pro-IL-1β 和IL-1β 含 量 显 著 下 调（P＜0.05，P＜0.01），而IL-18 有下调趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。LPS+J 组这三种因子含量比CON 组减少（P＜0.01，P＜0.001），姜黄素给药能显著抑制LPS 刺激细胞的IL-18 含量（P＜0.05），pro-IL-1β 和IL-1β 含量均不同程度的抑制，但无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 大鼠巨噬细胞中pro-IL-1β、IL-1β和IL-18的含量变化

2.4 大鼠巨噬细胞中ASC、Caspase1 和NLRP3 蛋白的表达变化 Western blot 结果显示，与CON 组比较，ASC 和NLRP3 蛋白在LPS 组中的表达明显下调（P＜0.01），在LPS+J 组中，ASC 表达无明显差异（P＞0.05），而NLRP3 显著下调（P＜0.01）。同时，与LPS 组比较，ASC 和NLRP3 在LPS+J 组中的表达均增加（P＜0.05）。此外，与CON 组比较，Caspase1 蛋白在LPS 组、LPS+J 组中的表达上调（P＜0.05），且LPS+J 组比LPS 组Caspase1 含量更高（P＜0.05）。见图4。

图4 大鼠巨噬细胞中ASC、Caspase1和NLRP3蛋白的表达变化

3 讨论

肺泡巨噬细胞是引起肺脏产生炎症反应的关键始动细胞，LPS 是促使其产生各种促炎因子的常用诱导剂。研究表明，一般情况下，LPS 作用后会促进巨噬细胞中的IL-1β 和IL-6 等炎症相关因子的表达升高［4］。研究中发现，LPS（100ng/ml）作用于大鼠巨噬细胞后，pro-IL-1β、IL-1β 和IL-18 三种炎症因子的表达与CON 组相比均有下调，这可能是由于LPS 作用时间延长所致。Matuschak 等研究发现，LPS 作用于巨噬细胞后，随着孵育时间的延长，IL-1β 含量明显增加，在6h 时达最高，此后明显下调，在24h 时下调至最低。为验证模型成功与否，进一步检测参与炎症反应过程中的两个关键蛋白iNOS 和HO-1，western blot 结果显示LPS 作用于细胞后，iNOS 和HO-1 含量明显上调，证实炎症模型成功。

大量体内外研究表明，姜黄素能有效抑制促炎因子的分泌，如IL-1β、IL-6 和IL-18 等。研究表明姜黄素及其新合成的羰基类似物能够通过调节p38MAPK活性抑制LPS 刺激引起的RAW264.7 巨噬细胞中促炎因子的表达，从而减轻炎症损伤［5］。这些研究提示，姜黄素可能能够减弱LPS 刺激引起的大鼠肺泡巨噬细胞的炎症反应。本资料显示，与空白组比较，姜黄素能显著下调LPS 损伤的原代大鼠肺泡巨噬细胞中pro-IL-1β、IL-1β 和IL-18 的表达，该结果与Lee WH 等发表的研究结果一致，证实姜黄素纳米颗粒能够显著减少LPS 诱导的NR8383 细胞促炎因子的含量［6］。ELISA 检测结果说明，姜黄素能够减轻LPS 损伤的原代大鼠肺泡巨噬细胞的炎症因子的表达。

在免疫细胞中，NRLP3 炎症小体是一种包含NLRP3 蛋白、ASC 和Caspase1 等参与形成的多蛋白复合物。研究［7］认为，巨噬细胞分泌IL-1β 有一个关键步骤为活化的NRLP3 炎症小体的诱导ASC 和Caspase1 将pro-IL-1β 剪切为其成熟的生物活性形式，从而诱发炎症反应。且有研究表明姜黄素能够减弱佛波酯刺激的巨噬细胞中NLRP3 炎症小体的激活，这可能与姜黄素调节TLR4/MyD88/NF-κB 信号转导通路有关。本资料显示，与CON 组比较，ASC 和NLRP3 蛋白在LPS 处理组中的表达显著下调，而姜黄素给药能显著抑制LPS 引起ASC 和NLRP3 蛋白的降低。同时，Caspase1 蛋白在LPS 组和LPS+J 组中的表达明显上调。提示姜黄素在大鼠肺泡巨噬细胞中的抗炎作用可能与调节ASC、Caspase1 和NLRP3 这三个炎症反应相关的蛋白有关，但具体调控机制需要进一步探索。

综上所述，姜黄素可以减轻LPS 诱导引起的大鼠巨噬细胞炎症反应，其作用机制可能与抑制促炎因子的含量和调节ASC/NLRP3/Caspase1 蛋白表达有关。此研究结果可能为研究姜黄素在肺泡巨噬细胞中的调节作用提供一定的实验基础。