张国林，李 倩，王正平

(苏州市药品检验检测研究中心，苏州 215000)

1 材料与方法

1.1 培养基及仪器

LA2-4A1型生物安全柜、AVC-6D1型超净工作台购自新加坡Esco公司；Sciencific 815型培养箱购自美国赛默飞世尔公司；KB240型培养箱购自德国Binder公司；PL602-L型电子天平、FE20型pH计购自瑞士梅特勒-托利多集团；胰酪大豆胨液体培养基(批号：20170629)、胰酪大豆胨琼脂培养基(批号：20190313)、麦康凯液体培养基(批号：20180626)、紫红胆盐葡萄糖琼脂(批号：20160728)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(批号：20180236)购自青岛海博生物技术有限公司；麦康凯琼脂培养基(批号：180113)购自北京陆桥技术股份有限公司；沙氏葡萄糖液体培养基(批号：20190419)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号：1070921)、肠道菌增菌液体培养基(批号：1702162)购自北京三药科技开发公司；RV沙门菌增菌液体培养基(批号：709895)购自BD公司。培养基适用性检查及检测方法验证用菌株见表1。

表1 培养基适用性检查及检测方法验证用菌株

1.2 大黄虫丸处方及制法

处方：熟大黄300 g，土鳖虫(炒)30 g，水蛭(制)60 g，虻虫(去翅足，炒)45 g，蛴螬(炒)45 g，干漆(煅)30 g，桃仁120 g，炒苦杏仁120 g，黄芩60 g，地黄300 g，白芍120 g，甘草90 g。制法：以上12味粉碎成最细粉，过筛，混匀，用水泛丸，干燥，打光，制成水丸。以上12味粉碎成细粉，过筛，混匀，每100 g粉末用炼蜜30～45 g加适量水泛丸，干燥，制成水蜜丸；或加炼蜜80～100 g制成小蜜丸或大蜜丸。

1.3 微生物限度检查方法[6]

参照2015年版《中国药典》非无菌产品微生物限度检查法<1105><1106>和企业标准，建立并验证微生物计数和控制菌检查方法。需氧菌总数检查采用培养基稀释法(0.2 ml/皿)，霉菌和酵母菌总数、控制菌检查均采用常规法进行。

1.3.1供试液制备

从至少2个独立包装中称取供试品12 g，加胰酪大豆胨液体培养基至120 ml，45℃水浴中保温振荡，使供试品分散均匀，作为1∶10的供试液。

1.3.2大肠埃希菌检查

取1∶10的供试液10 ml接种至100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，32 ℃培养箱培养24 h；取预培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42 ℃培养箱培养24 h。取上述培养物划线于麦康凯琼脂培养基上，32℃培养箱培养24 h，观察结果。

1.3.3耐胆盐革兰阴性菌定量检查

取1∶10的供试液21 ℃条件下放置约2 h，取相当于0.1、0.01、0.001 g供试品的预培养物或其稀释液(取1∶10的供试液 ml接种至9 ml胰酪大豆胨液体培养基中混匀，作为1∶100供试液；取1∶100的供试液1 ml接种至9 ml胰酪大豆胨液体培养基中混匀，作为1∶1000供试液)分别接种至10 ml肠道菌增菌液体培养基中，32 ℃培养箱培养48 h。上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，32℃培养箱培养24 h，观察结果。

1.3.4沙门菌检查

取10 g 供试品接种至100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，32 ℃培养箱培养24 h。取上述培养物0.1 ml接种至10 ml RV沙门菌增菌液体培养基中，32 ℃培养箱培养24 h。取RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基平板上，32 ℃培养箱培养24 h，观察结果。

1.3.5需氧菌总数检查

取1∶10供试液2 ml接种至10个平皿，每皿0.2 ml；1∶100供试液(取1∶10供试液1 ml接种至9 ml胰酪大豆胨液体培养基中混匀，作为1∶100供试液)1 ml接种至2个平皿，每皿1 ml。注入20 ml左右融化的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，倒置培养。胰酪大豆胨液体培养基代替供试液作为阴性对照。

1.3.6霉菌和酵母菌数检查

取1∶10供试液2 ml接种至2个平皿，每皿1 ml。每皿注入20 ml左右融化的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，倒置培养。稀释液代替供试液作为阴性对照。

1.4 统计学分析

采用Excel进行结果统计。计数资料采用百分比(%)表示。

2 结果

2.1 大黄虫丸来源分布

表2 大黄虫丸来源分布 批(%)

2.2 微生物限度结果

表3 微生物限度结果

3 讨论

微生物限度检查是中药制剂质量控制的重要方面，也是保障制剂安全的重要措施[7]。大黄虫丸是由12味药材制成的中药制剂，各成分均为药材原粉入药，具有很高的微生物污染风险。本研究通过对全国13家药品生产企业的190批大黄虫丸进行检查，发现不同批次和厂家制剂的微生物数量存在较大的差异性。其中大部分样品的需氧菌总数<1×101cfu/g，但也有2批的需氧菌总数≥103cfu/g，需引起注意。霉菌和酵母菌总数方面，大部分样品的计数结果<1×101cfu/g，但有16批的计数结果≥101cfu/g。

已有报道提出中药饮片的微生物污染较为严重，且耐热菌和耐胆盐革兰阴性菌的污染率高[8]。此外，中药饮片中沙门菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌等控制菌的检出率较高[9]。虽然不同于中药饮片，但大黄虫丸有12味药材原粉入药，其中4味为动物药，可能造成微生物污染的风险较大。但本研究发现190批大黄虫丸样品均未检出控制菌(仅个别样品在选择性平板上有菌落生长)，而且需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数2个指标结果均较好。基于检验结果推断，可能是生产企业较好地控制了原材料的微生物限度以及生产工艺和生产环境的洁净度，也可能是采用了某种形式的终端灭菌方法。

中药制剂中抑菌成分的存在会影响检查的结果。黄芩和大黄均为具有较强抑菌活性的中药，对常见的致病菌均具有抑菌作用[10-11]。研究发现黄芩、大黄等对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌等有抗菌作用[12]，且含有黄芩成分的外用制剂的微生物限度检查需采用培养基稀释法[13]。本研究也证实大黄虫丸在检查需氧菌总数时应采用培养基稀释法，但霉菌和酵母菌总数检查可采用常规法。