邢汉君，吴民熙,，郭照辉,，方雅瑜，罗容珺,，伍善东,，单世平,，冉启洋

(1.湖南恒凯环保科技投资有限公司，湖南 长沙 410000；2.湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410000；3.持久性有机污染微生物生态修复湖南省工程实验室，湖南 长沙 4100004.湖南省有机污染场地修复工程技术研究中心，湖南 长沙 410000)

随着全球工业化的迅速发展，石油和石油产品已经成为工业生产和日常生活中的主要能源来源，石油使用量急剧增加，每年产量约为4×109t[1]。但在石油的开采、运输、加工和使用过程中，部分石油进入周边土壤甚至地下水，造成石油污染，严重危害人类健康，其生态风险难以预估[2]。探索有效的石油污染修复治理技术已成为国内外研究者的关注重点。

石油污染物主要成分为石油烃，包含链烷烃、环烷烃和芳香烃，其中又以烷烃居多，约占石油烃总含量的50%以上[3]。短链烷烃(如甲烷)一般以气体形态存在，易挥发，正十六烷等中长链烷烃较难在环境中降解，易污染周边环境，是较常见的石油污染源。目前，石油污染物的修复方法主要包括物理法、化学法和生物法。相较于物理法和化学法，生物法具有成本较低、对原环境扰动较小、无二次污染等特点[4-6]。研究[7-9]表明，在适宜条件下大多数石油烃均能被微生物代谢、降解。因此，筛选出能够高效降解石油烃的微生物，成为微生物治理石油污染的关键环节。

作者通过富集培养，从长沙某地长期受石油污染的土壤中驯化筛选出一株能利用正十六烷作为碳源和能源的菌株，经形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析及系统发育树分析等对其进行鉴定，通过单因素实验研究了不同培养条件(初始pH值、培养温度、接种量和正十六烷初始浓度)对菌株 YJ1生长的影响及其对正十六烷的降解性能。旨在为石油污染场地微生物治理技术提供理论指导与技术支撑。

1 实验

1.1 材料、试剂与培养基

土壤样品：采集长沙某动力配件厂油库及其周边长期受油料污染的表层(0～12 cm)土壤，放入无菌自封袋中，冰袋保温，送回实验室后立即置于4 ℃冰箱保存。

聚合酶链反应(PCR)扩增试剂，TAKARA公司；柱式细菌DNA提取试剂盒，上海生工生物有限公司；通用引物，上海康朗生物科技有限公司；石油醚、正十六烷等试剂，国药集团化学试剂有限公司。

无机盐培养基：K2HPO4·3H2O 1.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NH4NO31.0 g，CaCl20.02 g，Fe2(SO4)30.02 g，正十六烷 10 mL，蒸馏水定容至1 L，调节pH值为7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min。

正十六烷无机盐培养基：1 L无机盐培养基加入正十六烷10 mL。

牛肉膏蛋白胨(BP)培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 10 g，蒸馏水定容至1 L，调节pH值为7.2，121 ℃灭菌20 min。

1.2 菌株的富集、纯化与筛选

将采集的10 g土壤样品加到含适量正十六烷无机盐培养基锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱中，于30 ℃、180 r·min-1培养5 d；吸取5 mL富集液置于95 mL新鲜的正十六烷无机盐培养基中培养，在相应琼脂培养基上进行分离和纯化，重复上述步骤。将纯化得到的单菌落转接入相应的无机盐斜面上，于4 ℃冰箱中保存。

1.3 菌株的鉴定

菌株形态特征以及生理生化特征鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[10]。基因序列分析采用16S rDNA进行[11]，送至上海生工生物技术有限公司进行测序。将测序结果在Genbank进行对比分析后，通过ClustalX 2.0和MEGA 7软件构建系统发育树。

1.4 菌株的生长特性

1.4.1 生长曲线的绘制

将筛选出的菌株用0.85%生理盐水进行稀释，直至菌悬液OD600值为 0.1时，吸取1 mL菌悬液接入99 mL BP培养基中，于30 ℃、180 r·min-1振荡培养，每隔2 h取一次样，用分光光度计测定OD600值，做3个重复。以OD600值表示该菌株的生物量。

1.4.2 不同培养条件对菌株生长的影响

以正十六烷作为唯一碳源，分别考察初始pH值(5、6、7、8、9)、培养温度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、接种量(2%、4%、6%、8%、10%)和正十六烷初始浓度(2 mL·L-1、5 mL·L-1、10 mL·L-1、15 mL·L-1、20 mL·L-1)对筛选菌株生长的影响。将培养至对数生长期的筛选菌株接种至含正十六烷的100 mL无机盐培养基中，分别在不同培养条件下180 r·min-1振荡培养10 d，培养期间每天观察菌株生长情况，每隔2 d用分光光度计测定OD600值，每组设3个平行。

1.5 菌株对正十六烷的降解率测定

菌株降解正十六烷实验：将培养至对数生长期的菌株按10%的接种量接入以10 mL·L-1正十六烷为碳源的无机盐培养基(pH=7)中，于30 ℃、180 r·min-1恒温振荡培养；以不加菌株为对照，分别恒温振荡培养5 d、10 d、15 d。整瓶提取培养液，用石油醚萃取后，测定对应波长下的吸光度，计算降解率，取样分析正十六烷残留量，每组设3个平行。

正十六烷标准曲线：将待测溶液经萃取后定容，测定吸光度并绘制标准曲线，得正十六烷标准曲线方程为：y=0.1969x-0.2173，R2=0.9976。

2 结果与讨论

2.1 菌株的形态、生理生化特征及分子生物学鉴定

通过筛选从土壤样品中分离得到一株能以正十六烷为唯一碳源生长的菌株，命名为YJ1，菌株形态见图1。

图 1 菌株YJ1在BP平板(a)和光学显微镜下(b)的菌落形态Fig.1 Colony morphology of strain YJ1 on BP plate(a) and under optical microscope(b)

菌株YJ1在BP培养基中菌落呈淡黄色，凸起，边缘齐整，表面湿润，不易挑起(图1a)；菌株YJ1在光学显微镜下呈直杆状，革兰氏染色呈阳性(图1b)。

菌株YJ1的生理生化特征见表1，化学敏感试验结果见表2。

表 1菌株YJ1的生理生化特征

Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain YJ1

注：“+”为阳性反应，“-”为阴性反应。

表2菌株YJ1的化学敏感试验结果

Tab.2 Results of chemical sensitivity of strain YJ1

注：“-”为不敏感，“+”为敏感。

将测得的菌株YJ1的16S rDNA序列在NCBI上进行比对和同源性分析，经系统发育树(图2)分析比对发现，其与短芽孢杆菌属(Brevibacillus)多个菌株序列的同源性较高，序列相似度达到79%。

图 2 基于16S rDNA序列构建菌株YJ1的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain YJ1 based on 16S rDNA gene sequences

通过对菌株YJ1的形态、生理生化特征和16S rDNA系统发育树分析，初步确定菌株YJ1属于细菌，在生物学上的分类属于短芽孢杆菌属。

2.2 菌株的生长曲线(图3)

从图3可以看出，0～10 h为菌株YJ1的生长延迟期，10～32 h为菌株YJ1的生长对数期，32～42 h为菌株YJ1的生长稳定期。当菌株进入生长对数期至稳定期时，测得的吸光度较高，表明此时菌株YJ1的生长繁殖能力较强，培养基中细菌总量较多。从44 h开始菌株YJ1进入衰亡期，由于前一阶段细菌的大量繁殖，使得此时培养基中的以正十六烷为主的营养物质基本被消耗完，培养基内细菌的平均死亡速率远快于其生长速率，造成细菌总量减少。

图3 菌株YJ1的生长曲线Fig.3 Growth curve of strain YJ1

2.3 不同培养条件对菌株YJ1生长的影响(图4)

pH值对细菌生长的影响主要表现在：一方面影响细胞质膜的透性和稳定性；另一方面通过对营养物质的溶解性或电离性影响微生物对营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率[14]。从图4a可以看出，菌株YJ1对初始pH值的适应范围较小，仅在初始pH值为6～8之间生长较好，在碱性条件(pH=9)下的生物量要大于酸性条件(pH=5)。菌株YJ1生长的最适初始pH值为7。

从图4b可以看出，培养温度过高或过低对菌株YJ1的生长影响较大，40 ℃时，菌株YJ1几乎停止生长；20 ℃时，菌株YJ1也生长缓慢。但培养温度为30 ℃、35 ℃时，菌株生物量明显高于其它温度条件下的，其中培养温度为30 ℃时菌株YJ1生长最佳。

图4 不同培养条件对菌株YJ1生长的影响Fig.4 Effect of different culture conditions on growth of strain YJ1

从图4c可以看出，菌株YJ1在不同接种量的培养液中培养2 d后都迅速生长，接种量大小与菌株生长呈正比关系，即接种量越大，菌株的生物量越多，即菌株适应环境的能力越强。其中接种量为10%的菌株YJ1生物量是接种量为2%的生物量的3倍左右，而菌株YJ1在接种量为2%的培养液中培养4 d后才逐步适应环境，生物量有所增加，6 d后生物量逐步下降。菌株YJ1生长的最适接种量为10%。

从图4d可以看出，在各正十六烷初始浓度条件下，培养0～6 d,菌株YJ1生物量快速增加。正十六烷作为菌株唯一的碳源，浓度越高可被菌株利用的物质就越多，所筛选菌株YJ1能很好地利用正十六烷。但培养10 d时，20 mL·L-1浓度的菌株生物量较其它浓度(除2 mL·L-1浓度外)的生物量低，可能是底物充足条件下，菌株大量代谢作用产生的代谢副产物对菌株产生一定的毒害，导致菌株活力减弱，生物量下降。菌株YJ1生长的最适正十六烷初始浓度为10 mL·L-1。

2.4 降解实验结果

菌株YJ1培养不同时间后对正十六烷的降解率见图5。

图5 菌株YJ1培养不同时间后对正十六烷的降解率Fig.5 Degradation rate of n-hexadecane by strain YJ1 cultured for different time

菌株YJ1以正十六烷为唯一碳源进行代谢活动，不断消耗培养基内的碳源。从图5可以看出，菌株YJ1在正十六烷初始浓度为10 mL·L-1的培养基中分别培养5 d、10 d、15 d时，对正十六烷的降解率分别为11.5%、63.5%、66.7%，可见随着细菌生物量增加，溶液中碳源减少，有毒副产物增加，导致降解率上升缓慢。同时说明所筛选菌株YJ1对正十六烷具备较强的降解能力。

3 结论

从长沙某长期受油料污染土壤中驯化筛选得到一株正十六烷降解菌YJ1，经形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析及系统发育树分析等对其进行鉴定，初步确定菌株 YJ1属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)。通过单因素实验确定菌株YJ1的最适培养条件为：初始pH值7、培养温度30 ℃、接种量10%、正十六烷初始浓度10 mL·L-1。在最适条件下培养15 d，菌株YJ1对正十六烷的降解率可达66.7%，降解效果良好。综合菌株的生长条件和降解能力，初步认为菌株YJ1较适用于类似石油污染中正十六烷污染修复。