刘 哲 刘志华 王亚明 张凤梅

(1. 昆明理工大学化学工程学院，云南 昆明 650106；2. 云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650231)

可可(TheobromacacaoL.)是一种梧桐科常绿乔木，主要产于中南美洲、西非及东南亚等地，中国从20世纪20年代开始引进种植。可可豆即可可果实种子，通常每颗果实含有30～50粒种子。可可豆在发酵[1-3]、烘焙[4-6]等加工处理前，一般不具有风味表现。Jinap等[7]研究发现可可豆在发酵过程中会受到内源性羧肽酶的影响，生成各种肽类物质和其他引起香味变化的挥发性物质；Hii等[8]研究发现，当烘焙温度为120～150 ℃时，伴随美拉德反应[9]的产生，生成更多含氮、含氧的可可豆特征风味物质；Acierno 等[10]基于HS-PTR-MS的方法，证实了生长环境等对可可豆品质的影响；Eskes等[11]对可可豆风味成分的形成进行分析，发现2-戊醇是形成可可豆的果香味和醇香口味的主要特征香气物质，乙酸仲丁酯是形成可可豆花香和清甜香的主要特征香气物质。上述研究主要针对引发可可豆特征风味的物质，但可可豆加工过程中会产生类似甘草风韵的苦涩口味，对后续制成可可类食品不利，主要通过添加辅料来掩盖苦涩口感[12]，目前针对可可豆苦涩形成机理及烘焙温度对苦涩味物质含量的影响尚未见报道。

试验拟对不同烘焙温度下的可可豆风味物质进行分离分析，重点分析可可豆苦涩味形成的原因，并利用热裂解温度升高的方法模拟烘焙温度对可可豆挥发性成分的影响，分析热解产物中苦涩味相关物质含量，以期为提高烘焙工艺中的可可豆风味品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

可可豆：云南中烟技术中心香精香料所；

凝胶色谱柱：瑞士Buchi公司；

Sephadex LH-20填料：瑞典GE Healthcare公司；

蒸馏水：10 MΩ，屈臣氏集团(香港)有限公司；

乙醇：色谱纯，迪科马科技(北京)有限公司。

1.1.2 仪器与设备

振荡器：HY-5型，金坛中大仪器厂；

混合型碾磨仪：RS200型，德国 Retsch公司；

旋转蒸发仪：R-210型，瑞士Buchi公司；

分析天平：感量0.000 1 g，德国Sartorius公司；

冷冻干燥机：2-4D型，德国Christ公司；

气相色谱—质谱联用仪：7890A/5975C型，美国Agilent公司；

液相色谱：1200型，配自动馏分收集器，美国Agilent公司；

气相色谱串联质谱联用仪：7890A/5975C型，德国Bruker公司；

CTC多功能自动进样器：Combi-xt PAL型，瑞士Combi-PAL公司；

热裂解仪：CDS5200型，配CIS3冷进样系统，美国CDS公司；

气相色谱仪：Clarus 600型，配Clarus 600 MS质谱检测器，美国Perkin Elmer公司。

1.2 试验方法

1.2.1 可可豆提取物的制备 参照文献[9]的方法并略作修改。选取颗粒饱满未发酵可可豆，分别在110，120，130，140，150，160 ℃下烘焙30 min，粉碎，取10 g可可豆粉末，置于200 mL具塞锥形瓶中，加入125 mL乙醇于室温下振荡1 h，使用滤纸过滤，滤液转移至250 mL茄形瓶中，再用10 mL乙醇洗涤滤渣，将洗涤液与滤液合并，于旋转蒸发仪中浓缩至黏稠状且表面无溶剂，即得可可豆提取物。

1.2.2 可可豆提取物水溶物的制备及分离 将葡聚糖凝胶用纯净水充分溶胀后，装填层析柱(2.6 cm×100 cm)，以水为流动相平衡24 h以上。取以50 g可可粉为原料提取的提取物，用60 mL蒸馏水溶解，过滤，滤液于-40 ℃冷冻后置于通风处干燥24 h，得到棕色黏稠状物即为可可提取物的水溶物。将水溶物溶于20 mL蒸馏水中，进行柱层析，以蒸馏水为流动相，流速1 mL/min，按时间连续收集，每个流分收集10 mL，共收集40个流分。

1.2.3 可可豆苦涩风味成分确认 按式(1)计算香气活力值(OAV)[13]。

(1)

式中：

OAV——香气活力值，kg/mL；

C——各香气组分的浓度，mg/mL；

T——感觉阈值，mg/kg。

OAV>1，说明该组分对整体香味贡献较大；OAV<1，说明该组分对整体香味影响很小。由于积分面积归一化法只能得到单一组分的相对浓度(Cr)，将式(1)中的绝对浓度(C)替换成相对浓度(Cr)，引入相对气味活力值(ROAV)，然后根据各组分相对含量与查阅到的感觉阈值[14]的比值进行比较，比值最大的即OAV值最大的香气组分。按式(2)计算相对气味活力值。

(2)

式中：

ROAV——相对气味活力值；

OAVn——单一组分的香气活力值，kg/mL；

OAVmax——香气活力值最大组分的香气活力值，kg/mL；

Cn——单一组分的相对含量，%；

Cmax——香气活力值最大组分的相对含量，%；

Tn——单一组分的阈值，mg/kg；

Tmax——香气活力值最大组分的阈值，mg/kg。

通过式(2)得出的相对气味活力值为0～100，且ROAV>1.0的组分为整体致香的关键组分，0.1

1.2.4 可可豆苦涩味流分分析 由6位评价人员通过直接嗅闻的方式对各流分的嗅觉特征进行辨识，获得具有嗅觉特征的流分，有4位以上评价人员结论一致时，辨识结果方被接受。将收集到的40个流分按照风味表现分类，然后对苦涩味的流分进行合并，使用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用分析合并流分的挥发性成分。

1.2.5 可可豆苦涩味复配 根据挥发性成分测定结果，挑选具有苦涩味或焦味的物质，根据文献[14]查询阈值，计算相对活力值，对以上筛选后的风味物质进行相对香气活力值计算，以ROAV>0.1的组分作为可可苦涩味的致香的关键组分进行重组复配及风味重组试验，然后对合并流分和重组模型进行感官评价。

1.2.6 可可豆提取物苦涩味流分和重组模型的风味特征评价 由6位感官评价人员通过直接嗅闻的方式，对分离出苦涩味的合并流分以及复配后的风味重组模型进行感官评价，评价标准为清甜香、正甜香、焦甜香、木香、焦香、苦涩香6个香韵特征，分值均为0～5分，分值越高说明强度越大，结果取6位感官评价人员的品吸分数平均值。

1.2.7 可可豆分段热解分析 准确称取可可豆粉末(1.0±0.5) mg于热裂解石英管中，并用石英棉堵塞石英管两端，将石英管装入热裂解仪。

(1) 裂解条件：裂解探针初始温度50 ℃，以5 ℃/s的速率分别升至110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160 ℃。各级附件初始温度50 ℃，终温200 ℃，保持5 min。吸附肼温度30 ℃，脱附温度260 ℃，裂解辅助气为氮气(N2)。

(2) 气相色谱质谱联用条件：DB-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱，进样口温度250 ℃，氦气流速1 mL/min；升温程序为起始温度40 ℃，保持1 min，以3 ℃/min的速率升温至300 ℃，保持10 min；分流比30∶1，总运行时间97.67 min。

(3) 电离方式：电子源轰击(EI)；离子源温度200 ℃，传输线温度280 ℃，电离能70 eV，质量扫描范围40～400 amu，溶剂延迟3 min。

1.3 数据处理

GC-MS数据由Nist05.d 标准谱库检索定性，挥发性物质的香气成分采用峰面积归一化法，以各化合物色谱峰面积相对百分比表示其相对含量，使用Origin 8.5对数据进行分析和图像处理。

2 结果与讨论

2.1 可可豆提取物苦涩味流分筛选和致苦物质确认

2.1.1 苦涩味流分分离 由表1可知，对可可豆提取物进行风味物质分离时，按时间分离的顺序依次为醇香味、脂香味、焦甜香味、苦涩味和焦糊味，编号为26～34的流分表现出苦涩味特征，即试验所需的可可豆提取物苦涩味流分。

2.1.2 苦涩味流分分析 将苦涩味流分合并，根据文献[15]的固相微萃取条件选取粉色(65 μm，PDMS/DVB，Stableflex 24 Ga)的萃取头，80 ℃下萃取30 min，解吸3 min，对合并流分进行顶空萃取结合气相色谱质谱联用分析。由表2可知，未烘焙的可可豆挥发性物质总相对含量要高于烘焙后的可可豆，但3-甲基丁醇、2-甲基丙醇等苦涩味的物质含量也要高于烘焙后的可可豆，符合美拉德反应的特征，温度升高对可可豆提高醇香有一定的促进作用。

表1 可可豆提取物苦涩味流分的香味特征

表2 不同烘焙温度下苦涩味流分各物质的相对含量†

续表2

种类化合物名称保留指数苦涩味流分物质的相对含量/%未烘焙110 ℃120 ℃130 ℃140 ℃150 ℃160 ℃香气类型酯类庚酸乙酯1 3260.040.040.010.000.000.290.29果香苯甲酸乙酯1 6400.270.230.600.000.090.120.77甘菊香、水果香丁内酯1 5910.090.410.000.070.362.090.27焦糖香、奶酪香、烤坚果香、甜味乙酸苯乙酯1 7870.110.290.010.00-0.012.21花香、烟草香呋喃类2-甲基呋喃 8150.040.000.050.000.020.05--乙烯呋喃9580.050.04-0.000.020.09-烟味2-戊基呋喃1 2130.060.00-0.000.780.000.01黄油味、绿豆香2、5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮2 032-0.080.240.450.680.691.12烧焦味、焦糖香、甜香醛类2-甲基丙醛 8270.010.270.380.290.410.790.82烧焦味、焦糖香、3-甲基丁醛9190.270.020.000.010.000.000.06可可香、鲜草香、麦芽香、辛辣味戊醛9571.580.010.020.00-0.00-杏仁味、苦味、辛辣味(E)-2-甲基-2-丁烯醛1 0890.030.010.020.000.030.000.00-辛醛1 2720.110.010.000.050.020.000.00柑橘味、油脂味、青草香、辛辣味苯甲醛1 4944.253.963.640.013.450.011.29苦杏仁味、焦糖香α-亚乙基苯乙醛1 8920.000.020.000.040.000.000.00可可香、烤香、甜香5-甲基-2-苯基-2-己烯醛2 0420.070.000.010.010.010.010.01可可香酮类2-戊酮 96112.410.03--0.01--烧焦味、水果味、辛辣味2,3-二戊酮1 0500.27-0.091.051.850.950.92苦味、黄油味、焦糖香、奶油香(E)-3-戊烯-2-酮1 1120.110.780.040.180.08-0.01-2-辛酮1 2730.090.060.110.220.100.540.03芳香、皂香苯乙酮1 6180.040.020.040.070.110.060.44杏仁味、花香甲基环戊烯醇酮1 8000.050.04-0.150.110.160.03香油味、甜香烯烃β-月桂烯1 1540.060.050.600.030.480.040.09果香、花香、香草味D-柠檬烯1 2050.010.080.800.040.010.670.04柑橘香、薄荷香吡嗪类甲基吡嗪1 2510.140.061.890.021.130.260.11可可香、青草香、烤香2、5-二甲基吡嗪1 306-0.380.690.671.242.374.15烧焦味、可可香2、6-二甲基吡嗪1 3140.330.07-0.830.04-0.00可可香、青草香、咖啡香乙基吡嗪1 3180.480.02-0.520.250.390.47烧焦味2、3-二甲基吡嗪1 3300.710.060.022.280.020.150.00焦糖香、可可香2、3-二甲基-5-乙基吡嗪1 4031.100.00-0.60-0.860.97烧焦味、绿豆香2、6-二乙基吡嗪1 4170.281.100.130.020.030.01-青草香3、5-二乙基-2-甲基吡嗪1 4750.070.010.000.040.000.010.00烤香、可可香、甜香其他吡啶1 1710.04--0.09-0.130.26烧焦味、辛辣味1-乙酰基吡咯烷1 8050.090.03-0.020.020.000.00-2-甲氧基苯酚1 8260.140.02--0.380.550.67烧焦味、药香、烟味麦芽酚1 9300.240.000.120.010.250.030.01焦糖香、麦芽香、烤面包香、烤坚果香2-乙酰吡咯1 9900.070.020.050.150.020.03-面包香、可可香、榛子味、甘草香、烤香2、3-二氢-3、5-二羟基-6甲基-4H-吡喃-4-酮2 253--0.03-0.071.241.58苦味、土腥味、香草味、烤香

† “-”表示未检测到或香气特征未知。

由表3可知，相对活力值的关键组分为2-甲基丙醛，2-甲氧基苯酚、2-庚醇、戊醛、2-戊酮、苯甲醛、2，5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮，但这些物质多数相对含量要远低于修饰组分中的某些物质。在化合物相对含量一定的情况下，阈值越低，即嗅觉辨识该物质的最低浓度越低，则相对香气活力值越大，对参与物质风味形成的贡献也就越大。

表3 苦涩味或焦味物质的阈值和ROAV†

† “-”表示未查阅到。

2.1.3 可可豆苦涩味复配与感官评价 筛选风味物质时，将每种单一组分的风味表现作为参考，从苦涩味流分中仅挑选出表现苦涩味或焦味的物质，如苯乙酮、丁内酯、麦芽酚等感官体验上脂香和甜香味明显高于苦涩味的组分同样不参与重组试验。由图1可知，重组模型的木香和焦香味与原流分差别较大，但苦涩味和甜香相似度较高，因此可认为2-甲基丙醛、2-甲氧基苯酚、2-庚醇、戊醛、2-戊酮、苯甲醛、2，5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮、3-甲基丁醇、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪及2-甲基丙醇12种物质是形成可可豆苦涩味的主要致香组分。

图1 原流分与重组模型的苦涩味感官评价雷达图

Figure 1 Sensory evaluation radar chart of bitter taste of original sample and reconstituted model

2.2 模拟不同烘焙温度下可可豆的分段热裂解对比分析

由图2可知，随着烘焙温度的升高，伴随着美拉德反应，可可豆挥发性成分的物质种类和相对含量也随之发生变化，主要有醇类、酯类、醛类、酮类、酸类、烯烃类和其他吡嗪类化合物[16]。未烘焙和145 ℃下烘焙的可可豆分别检测出69，85种化合物，说明不同烘焙温度对可可豆的热解产物有较大影响，在一定范围内，温度越高，可可豆的挥发性产物越多。

图2 不同烘焙温度下可可豆的色谱图

由图3可知，在不影响可可豆原有风味的前提下，减少致苦涩味关键组分[2-甲基丙醛、2-甲氧基苯酚、2-庚醇、戊醛、2-戊酮、苯甲醛、2，5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮]和致苦涩味修饰组分(3-甲基丁醇、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2-甲基丙醇)的含量便可有效降低可可豆中苦涩味对口感的影响。当热解温度为110～120 ℃时，可可豆挥发性物质的相对含量均有所上升，说明在此温度范围内进行烘焙，可增进可可豆的香味，但致苦涩组分含量也有所上升(从8.84%上升到10.18%)，说明此温度下烘焙的可可豆风味并未满足要求。当热解温度为130～135 ℃时，致苦涩组分和其他组分的相对含量分别达到最低值(4.78%)和最高值(74.62%)。故在不影响可可豆原有风味的前提下，若要将可可豆的苦涩味最大程度地减少，烘焙温度应控制在130～135 ℃。当热解温度为135～160 ℃时，可可豆粉末的致苦涩组分和其他风味组分分别出现上升、下降趋势，说明该温度烘焙的可可豆风味已受到影响。

图3 不同热解温度下可可豆粉末各组分的相对含量变化

Figure 3 Change of relative content of cocoa powder components under different pyrolysis temperature

3 结论

① 可可豆提取物苦涩味流分共检测出55种挥发性成分，其中醇类7种，酸类5种，酯类9种，醛类8种，酮类6种，烯烃类2种；② 致苦涩味的关键组分为2-甲基丙醛、2-甲氧基苯酚、2-庚醇、戊醛、2-戊酮、苯甲醛、2，5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮，修饰组分为3-甲基丁醇、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2-甲基丙醇；③ 130～135 ℃为降低可可豆苦涩味的最佳烘焙温度。

目前已知可可豆挥发性成分高达500余种[17]，主要有醇类、醛类、酮类、酯类和一些酸类物质，每种成分可能都与可可豆的风味形成有着密切的关系，试验将已检测出的其他挥发性成分相对含量加和与致苦涩组分进行比较分析，将影响可可豆风味的因素与其他物质的总含量变化关联，但实际烘焙过程中温度对可可豆单一风味物质变化影响需进一步研究分析。