林 玥， 刘红梅， 谢裕安

(广西医科大学附属肿瘤医院,实验研究部，南宁 530021)

肝细胞癌是消化道常见肿瘤，在原发性肝癌中约占90%[1]。肝癌起病隐匿，探究早期诊断的生物标志物，可以为诊断和评估肝癌患者预后提供有价值的信息[2]。溶胶蛋白超家族是一类钙离子依赖性肌动蛋白结合蛋白，在生理和病理细胞的运动中都发挥着关键作用，其通过调控肌动蛋白细胞骨架参与肿瘤的发生和进展[3]。凝溶胶蛋白超家族成员中几大核心成员如凝溶胶蛋白(GSN)[4]、绒毛膜蛋白(Villin)[5]、加帽蛋白(CapG)[6]是潜在的肿瘤标志物，这一观点已经得到中外研究证实[7]。Advillin(AVIL)是凝溶胶蛋白家族的新成员，与凝溶胶蛋白家族成员共享6个凝溶胶蛋白同源(GH)结构域，具有对肌动蛋白捆绑、结合的功能[8]。前人对Advillin的研究主要集中在Advillin与Villin相似的序列方面[9]，而其在肿瘤中的研究鲜有报道。

为此，基于Advillin与Villin具有极其相似的序列和功能的前提下，推测AVIL是影响肿瘤发生发展的一个新的生物标志物，采用免疫组化验证的方法，分析AVIL基因在原发性肝细胞癌与癌旁组织的表达差异，探讨其与临床病理参数的相关性以及预后的关系，以期为肝细胞癌相关研究提供新的观点。

1 材料与方法

1.1 病例资料

回顾性收集2013年10月—2016年12月于广西医科大学肿瘤医院行肝癌根治术并具有完整资料的76例原发性肝癌患者，所有病例手术标本均经病理证实为肝细胞性肝癌且固定于10%福尔马林并行常规石蜡包埋，所有病例均无术前放疗或化疗等辅助治疗史。所有标本获取过程均按照伦理程序，并获得医院伦理委员会的批准。

1.2 临床资料

临床分期根据BCLC分期进行划分。肝细胞癌分化程度分级采用的Edmondson分级法。

76例原发性肝癌组织中，男性66例，女性10例；年龄28～77岁，平均年龄53.2岁；有肿瘤家族史16例，无肿瘤家族史60例；临床BCLC分期，A～B期50例，C期26例；肿瘤直径<5 cm者26例，≥5 cm者50例；病理Edmondson分级，I～II期41例，III～IV期35例；伴有癌栓者36例，无癌栓者40例；肿瘤多灶性35例，无多灶性者例41例；伴有AFP<8.04 ng/mL者26例，8.04 ng/mL者50例；伴有ALT<40 U/L者48例，40 U/L者28例；伴有AST<37 U/L者35例，37 U/L者41例；伴有γ-GT<50 U/L者35例，50 U/L者41例；伴有HBsAg者68例，无HBsAg者8例；伴有肝硬化者48例，无肝硬化者28例；肿瘤转移患者19例，非转移患者57例。同时选取对应的76例癌旁组织作为对照。

随访结束截至2019年3月12日，其中死亡患者23例；失访2例；存活51例。将死于肝癌记为终点事件，其他情况则记为截尾事件，生存时间均按月计算。

1.3 主要试剂与仪器

兔抗人AVIL单克隆抗体(1∶150)购自英国Abcam公司；即用型SP试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司；PBS磷酸盐缓冲液(粉剂)、柠檬酸抗原修复液(干粉)、苏木素购自福建迈新生物技术有限公司；中性树脂、二甲苯、多浓度梯度乙醇、烤箱等均由广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部提供。

1.4 免疫组化染色及结果判读

采用免疫组化SP法(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法)对石蜡切片组织进行检测，具体操作方法按照试剂说明书进行。结果判读：每张切片随机选择5个高倍视野(×400)，每个视野下计数100个肿瘤细胞，根据染色细胞百分率计分标准:0 分为≤10%，1 分为11%～25%，2 分为26%～50%，3 分为51%～75%，4 分为>75%；染色强度的计分标准:无着色计为0 分，浅棕色计为1 分，棕色计为2 分，深棕色计为3 分。上述两项分值之和判断其结果:0 分为阴性(-)，2 ～ 3分为弱阳性(+)，4 分为中度阳性(++)，5 ～ 6 分为强阳性(+++)。得分≥4分为高表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS统计软件进行数据录入和分析，两组表达差异以及表达水平与临床参数间关系均采用χ2检验。生存曲线采用Kaplan-Meier法、Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞癌与癌旁中组织中AVIL的表达水平

AVIL蛋白主要表达于肝细胞癌组织中，其在肝细胞癌中阳性率为64.5%，而在配对癌旁组织中多为低表达，阳性率仅为43.4%，差异有统计学意义(χ2=6.779，P=0.009<0.05)，如表1、图1所示。

表1 AVIL在肝癌及配对癌旁组织中的蛋白表达水平

注：*表示该值P<0.01。

图1 AVIL基因在肝细胞癌和癌旁组织中的蛋白表达水平

2.2 AVIL表达与肝细胞癌患者临床参数之间的关系

统计学分析结果显示，AVIL表达与肝细胞癌患者BCLC分期、Edmondson分级有关(P<0.05)，而AVIL表达与患者性别、年龄、有无肿瘤家族史、肿瘤大小、AFP、ALT、AST、γ-GT、HBsAg、有无癌栓、有无多灶性、有无肝硬化、有无转移无关(P>0.05，表2)。相比临床早期(BCLC-A～B期)的患者，AVIL蛋白表达在临床晚期(BCLC-C期)患者中的表达明显升高(P<0.05)。相比病理分级低(Edmondson I～II期)的患者，AVIL蛋白表达在病理分级高(Edmondson III～IV期)患者中的表达明显升高(P<0.05)，如表2所示。

表2 AVIL差异表达水平与肝癌患者各临床参数之间的关系

注：**表示采用Fisher精确概率法；△表示该值P<0.05。

2.3 AVIL表达与肝癌患者生存时间的关系

将免疫组化染色的76例肝癌样本根据其表达值划分成AVIL低表达(<4分)组和AVIL高表达(≥4分)组，采用Kaplan-Meier生存分析法，结果表明，AVIL蛋白高表达组肝癌患者的生存时间显著低于低表达组，差异有统计学意义(P<0.05)，如图2所示。单因素分析表明，AVIL表达水平、BCLC分期、肿瘤大小、有无癌栓、有无多灶性、AFP、AST、γ-GT、有无肝外转移与肝细胞癌癌患者预后相关 (P<0.05),患者的年龄、性别、有无肿瘤家族史、Edmondson分级、ALT、HBsAg、有无肝硬化等与患者预后无显著相性。多因素分析结果表明，多发子灶是肝细胞癌患者预后的独立影响因(P=0.043)，而AVIL表达水平、BCLC分期、肿瘤大小、有无癌栓、AFP、AST、γ-GT、有无肝外转移并不是影响预后的独立因素，如表3所示。

图2 AVIL基因不同表达水平对肝癌患者生存时间的影响

3 讨论

AVIL定位于染色体区域12q14，蛋白分子质量为92 kD[10]。其编码的蛋白最初是通过筛选小鼠脑cDNA文库中鉴定发现的凝溶胶蛋白家族新成员，因其氨基酸序列与同属于凝溶胶蛋白家族的Adseverin和绒毛蛋白(Villin)分别有65%和75%的高度同源性而被命名为Advillin[11]。凝溶胶蛋白是一种肌动蛋白结合蛋白，具有对肌动蛋白捆绑、结合和维持性质的功能，在细胞运动中发挥重要作用，包括肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等过程[12]。Advillin与凝溶胶蛋白家族成员共享6个凝溶胶蛋白同源(GH)结构域，以及含有与Villin相似的羧基末端头部结构(cHP)[9]。cHP是决定肌动蛋白捆绑能力的重要区域，具有与F-肌动蛋白结合的功能[13]。

表3 肝癌患者的Cox单因素及多因素分析

注：多变量模型中仅纳入单变量模型有统计学意义的变量；▽表示该值P<0.05, ▲▲表示该值P<0.01。

AVILmRNA主要在成人胃肠道、骨骼肌中表达，在其他组织表达水平非常低[14]，其中在胎儿肠中最低。AVIL具有调控细胞运动的能力，其可以通过产生片状伪足和局灶性粘连，影响调控足细胞迁移率(PMR)[15]，一旦AVIL发生隐性突变会降低体外蛋白质的肌动蛋白成束能力，使足细胞功能的丧失诱导肾病综合症的发生[8]。研究发现，AVIL是一种促进纤毛生成的调节剂，它能切断肌动蛋白丝来调节细胞骨架肌动蛋白组织进而控制纤毛的长度[16]。多年来，人们对AVIL编码的Advillin蛋白了解主要围绕其是一种感觉神经元特异性肌动蛋白结合蛋白。许多研究反复证实， Advillin与神经突生长和形态发生以及轴突再生密切相关[17-18]，其丰富表达于背根神经节之中[19]。Chuang等[20]在患有疼痛性周围神经病的小鼠的脑脊液中检测到由Advillin蛋白，并认为其是诊断周围神经病变的生物特征。同家族成员Villin，已被证实与多种消化道肿瘤具有明确的相关性[21]。李峰等[22]研究发现Villin在肝细胞癌中的表达明显高于正常肝组织，认为其可能作为一种癌基因参与肝细胞癌的发生发展。然而，AVIL(Advillin)在肿瘤中的相关研究仍较空白。为了更多了解凝溶胶蛋白超家族蛋白在肿瘤的表达及功能，将AVIL作为肿瘤标志物或治疗靶点的潜力。基于AVIL与Villin具有极其相似的结构和功能，推测其可能是一个新的肿瘤标志物。

通过免疫组化法分析可知，AVIL主要在癌组织中高表达阳性率达64.5%，表明AVIL(Advillin)作为凝溶胶蛋白家族中的成员之一，可能与同家族成员Villin相似，在肝癌发生过程中能发挥促癌的作用[23]。肝癌的分期对判断患者预后十分重要。晚期原发性肝癌总体预后差，多数据统计报道中位生存期均小于1年[24]。目前，对原发性肝癌晚期范围界定一直比较模糊。BCLC分期中将处于BCLC-C期的患者定义为晚期，肝癌晚期的患者存在多发子灶或远处转移，治疗难度大，预后较差。结果表明，AVIL高表达的患者，临床分期更差、病理分级更高(P=0.032、P=0.033)，其表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关。因此，AVIL表达水平可能用于肝细胞癌恶性程度及患者预后趋势的评估。

通过Kaplan-Meier生存分析发现，AVIL低表达患者的术后生存时间明显高于高表达患者。Cox单因素表明，AVIL表达水平、BCLC分期、肿瘤大小、有无癌栓、有无多灶性、AFP、AST、γ-GT、有无肝外转移都是影响患者生存时间的相关因素，差异有统计学意义(P<0.05)。将上述9个具有统计学意义的单因素代入Cox多因素分析，结果表明，多发子灶可作为预测肝细胞癌患者预后不佳的一个独立因素(P=0.043)，此外，其余8个因素与预后有相关性，但不能作为影响肝癌患者预后的独立因素。

综上所述，AVIL可能是一个新的癌症相关基因，它与原发性肝细胞癌的发生发展以及与肝癌患者的生存预后有密切联系。AVIL高表达提示肿瘤恶性程度高、预后不佳，可能作为肝细胞癌患者有意义的生存期预测因子，但不作为一个判断预后的独立因素，同时发现肿瘤多发子灶可作为判断预后的独立危险因素。由于目前只验证了部分临床标本，其在肿瘤中的机制及功能还不明确。肝癌的发生发展与肿瘤细胞的活动密切相关，表明存在大量调节细胞调节因子，不能排除其他凝溶胶蛋白家族成员在过程中的影响。AVIL基因是否能作为一个有效的肿瘤标志物，还有待进一步研究和探索。

4 结论

(1)AVIL高表达提示肝癌患者恶性程度高、预后不佳，其表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关。

(2)AVIL是肝癌患者有意义的生存期预测因子，但不作为一个判断预后的独立因素。