牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277菌株外切聚磷酸酶的表达、纯化和结晶

2020-04-08张爱莉卢作焜李蓉芳李文文

科学技术与工程 2020年3期

张爱莉，卢作焜，李蓉芳，李文文

(许昌学院食品与生物工程学院，河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室，许昌 461000)

多聚磷酸盐(polyphosphate，polyP)由正磷酸残基组成，其长度可达到上百个，在所有的真核和原核细胞中都能发现多聚磷酸盐的存在[1-2]。在真核细胞中，polyP能够显著影响DNA损伤后的细胞修复[3]。在细菌中，polyP不仅参与严紧反应，还对增强牙龈卟啉单胞菌、结核分枝杆菌以及铜绿假单胞菌等病原菌的毒性、感染性、静止期耐受性以及抗生素耐药性等生理活动起着至关重要的作用[4-7]。因此，细胞中polyP浓度的调控对细菌的生长、存活、适应及感染等许多生理学过程十分重要。

外切聚磷酸酶(exopolyphosphatase，PPX)是细菌中水解polyP的主要蛋白[8]。研究发现PPX对几种主要病原菌(如结核分枝杆菌和脑膜炎奈瑟氏菌)的致病机理、静止期存活以及抗生素耐受性等必不可少[9]。同时，polyP与PPX在嗜热金属球菌的铜离子抵抗中具有重要作用[10]。PPX蛋白属于外切聚磷酸酶/鸟苷五磷酸磷酸水解酶(PPX/GppA)家族蛋白。目前，针对PPX/GppA蛋白家族的研究主要集中在该家族蛋白的生理学重要性，而关于其结构的研究尚鲜见报道，仅2种PPX/GppA同源蛋白的结构被报道，分别是来源于超嗜热菌的PPX蛋白和大肠杆菌的PPX蛋白[11-13]，而来源于运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的PPX/GppA同源蛋白的野生型、截短体和活性位点突变体的X射线晶体学研究近期也被报道[14]，亟待进一步深入研究该家族蛋白。

引起成人牙齿脱落的原因很多，其中最主要是牙周炎，牙周炎也是人类最经常发生的传染性疾病之一[15-17]。而牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)是引起严重慢性牙周炎和侵袭性牙周炎的主要病原体[15]。研究表明，该病原菌的重组RgpB蛋白可以激活人口腔成龈纤维细胞的钙离子通路[18]，其脂多糖能够通过增加抗炎症因子的生成来降低口腔不良反应[19]；Porphyromonasgingivalis也与类风湿性关节炎等多种系统性疾病相关[20]。此外，最新研究发现，引起阿尔茨海默症的真正原因很可能是Porphyromonasgingivalis[21]。

PorphyromonasgingivalisATCC 33277菌株是牙龈卟啉单胞菌的模式菌株，其基因组仅含有一个编码外切聚磷酸酶的基因PGN_0378，编码的外切聚磷酸酶(PgPPX蛋白)由302个氨基酸残基组成[22]。Porphyromonasgingivalis381的多聚磷酸激酶1(PPK1)蛋白能够合成polyP，该蛋白基因的缺失会引起生物膜形成和静止期存活的缺陷[4]。据此，并结合PPX蛋白在其他病原菌致病中的重要作用，可以推测PgPPX蛋白也与Porphyromonasgingivalis的致病性以及严紧反应等生理活动至关重要，该蛋白极有可能作为潜在的抗Porphyromonasgingivalis的药物靶标。然而，目前关于Porphyromonasgingivalis中PPX/GppA家族同源蛋白PgPPX的表达与纯化以及结构的报道仍处于空白。

为此，利用分子克隆技术对PorphyromonasgingivalisATCC 33277菌株的外切聚磷酸酶(PgPPX)的基因进行克隆和重组载体构建，表达、纯化后对目的蛋白进行晶体生长与对比，以期后续对该致病菌中的外切聚磷酸酶进行X射线晶体学研究，对基于结构基础的药物设计提供一个起点，为更为有效地治疗牙周炎提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

菌株与质粒：大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)， pGEX-6p-1质粒。

其他试验材料及来源如表1所示。

表1 试验材料

1.2 方法

1.2.1 重组表达载体的构建与转化

以PorphyromonasgingivalisATCC 33277菌株为扩增模板，利用PCR技术对PgPPX的编码序列PGN_0378进行扩增。采用T4 DNA连接酶将双酶切后的目的基因片段连接至pGEX-6p-1载体，使表达的PgPPX蛋白序列N端具有谷胱甘肽硫转移酶(GST)标签和HRV3C蛋白酶酶切序列。提取质粒后鉴定扩增的重组质粒(由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成)。将正确克隆的重组质粒利用化学转化法转化至感受态大肠杆菌BL21中。基因PGN_0378的分子克隆信息如表2所示。

表2 分子克隆信息

1.2.2 PgPPX融合蛋白的表达

使用非代谢的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在不同的浓度下诱导目的融合蛋白的过量表达，4 ℃预冷的PBS缓冲液(10 mmol/L Na2HPO4、2.7 mmol/L KCl、140 mmol/L NaCl、1.8 mmol/L KH2PO4，pH=7.4)悬起收集的菌体细胞，并采用超声波细胞破碎仪破碎[23]。

1.2.3 PgPPX蛋白的纯化

1.2.4 PgPPX结晶条件的筛选

采用坐滴气相扩散法对晶体生长条件进行筛选[24-25]，所使用的结晶池液条件包括Hampton Research公司生产的Crystal Screen Kit I、II，Index，PEG/ION I、II，Salt Rx I、II，PEGRxI、II和Emerald BioSystems公司的Wizard I、II、III、IV等晶体生长试剂盒。

2 试验结果

2.1 重组表达载体的构建和鉴定

通过PCR技术扩增PgPPX蛋白基因PGN_0378。重组质粒的DNA测序结果经过比对后表明，pGEX-6p-1载体中克隆入的外源目的基因序列与NCBI的Nucleotide库中PGN_0378的DNA序列信息相吻合，一致性达到100%。说明已成功将PgPPX蛋白的基因构建到pGEX-6p-1载体中，得到重组质粒。

2.2 PgPPX蛋白的表达和纯化

分别取HRV3C蛋白酶酶切前的柱上样和酶切后的流穿样制样。由图1可知，PgPPX-GST融合蛋白(泳道2，分子质量约为60 kDa)已被蛋白酶切开，洗脱的目的蛋白电泳条带位置(泳道1)与预测的分子质量(33.7 kDa)接近。

图1 融合蛋白GST亲和层析后的13%SDS-PAGE检测

PgPPX蛋白的阴离子交换层析图谱如图2所示，其中蓝色曲线表示蛋白质在280 nm波长处的吸光值，棕色曲线表示线性NaCl的浓度梯度(Buffer B的混合百分比)。由图2可知，PgPPX蛋白在离子强度梯度提高过程中形成了一个分布比较集中、对称的洗脱峰，洗脱峰出现在29%Buffer B附近。离子交换层析图谱表明PgPPX蛋白有较高的电荷均一性。

图2 阴离子交换层析图谱

SDS-PAGE电泳结果如图3所示，表明PgPPX纯度较前一步骤得到了进一步的提高。

图3 阴离子交换层析后收集部分的13%SDS-PAGE检测

PgPPX蛋白的凝胶过滤层析色谱图如图4所示，在14.3 mL附近有一个峰型较为对称的目的蛋白洗脱峰，将其与标准样品在Superdex200 10/300 GL凝胶过滤层析柱的洗脱图谱进行比较，得知蛋白样品洗脱峰对应分子质量约为67 kDa，表明PgPPX蛋白在此溶液中主要为二聚体形式。

图4 凝胶过滤层析图谱

凝胶电泳结果(图5)表明，主要洗脱峰均为PgPPX蛋白，且纯度已经达到95%以上。

图5 凝胶过滤层析后收集部分的13%SDS-PAGE检测

2.3 PgPPX蛋白的浓度鉴定

收集凝胶过滤层析后的目的蛋白洗脱峰进行超滤浓缩，利用Nanodrop超微量分光光度计检测蛋白质浓度，结果表明，LB培养基的PgPPX表达量高达30 mg/L。

2.4 PgPPX结晶条件的筛选

晶体培养约7 d后，在显微镜下观察到有3个条件中均有晶体长出，分别是PEG/ION的32号条件[0.2 mol/L MgSO4·6H2O、20% PEG3350(m/V)]，PEG/ION的39号条件[0.2 mol/L NaH2PO4·H2O、20% PEG3350(m/V)]和Wizard IV的29号条件[pH=4.0、0.1 mol/L C6H5Na3O7/C6H8O7,0.2 mol/L C6H5Na3O7，20% PEG3350(m/V)]，获得的晶体如图6所示，形状分别为棍状、针状、薄片状簇生。其中，PEG/ION-32条件下获得的晶体形状最好，为较粗的长棍状，而其他两个条件下获得的晶体形状不规则且为挛晶，这与在室内Rigaku MicroMax-007 HF旋转阳极X射线衍射仪下的初步衍射结果一致。

图6 筛选得到的晶体

3 讨论

Porphyromonasgingivalis表现出一定的抗生素耐药性，是造成最严重的抗生素耐药问题的少数病原体之一[16]。除牙周炎之外[15-19]，大量研究表明Porphyromonasgingivalis还与类风湿性关节炎和阿尔茨海默症等多种系统性疾病相关[20-21]。相比于骨关节炎，类风湿性关节炎患者，牙周炎的发病率更高，发病情况更加严重[26]。此外，Porphyromonasgingivalis能通过降低与B细胞激活相关的炎症反应，进而抑制阿尔茨海默症患者中的适应性免疫系统[27]；最新研究发现，阿尔茨海默症患者的认知衰退越严重，其大脑中的Porphyromonasgingivalis数量越多；小鼠试验证实了Porphyromonasgingivalis进入大脑后释放的一种分泌蛋白才是导致阿尔茨海默症的真正原因[21]。综上所述，病原菌Porphyromonasgingivalis不容小觑，除病理学研究外，还急需对影响其生存、感染的蛋白质展开生化研究。

牙周炎患者牙周袋中恶劣的炎症环境表明，Porphyromonasgingivalis一定有能力帮助其应对和适应外界的氧化、营养等压力。由于病原菌抵抗外界环境压力的严紧反应也是其致病性的关键因素之一。因此，应针对Porphyromonasgingivalis中和病理生理学以及严紧反应相关蛋白的结构和功能进行研究，以期为抗Porphyromonasgingivalis药物的开发，以及有效预防和治疗牙周炎奠定基础。然而，至今关于Porphyromonasgingivalis中与病原菌的致病性、严紧反应和对抗生素耐药起关键作用的PPX/GppA家族同源蛋白的表达、纯化以及结构与功能的报道仍处于空白。

为此，通过对PorphyromonasgingivalisATCC 33277中编码外切聚磷酸酶的基因PGN_0378进行重组载体构建和外源表达。利用GST亲和层析纯化融合蛋白后，切除GST标签。由于蛋白质X射线晶体学的研究工作需要获得大量的性质均一、稳定的目的蛋白，从而来进行蛋白质晶体的培养及优化。因此，依次采用3种层析技术对PgPPX蛋白进行了纯化，成功得到了纯度极高、性质均一的大量目的蛋白。

PgPPX蛋白的预测分子质量为33.7 kDa，而其凝胶过滤层析色谱图表明PgPPX蛋白在此溶液中主要为二聚体形式。这种现象与其他PPX/GppA家组蛋白的情况一致，例如大肠杆菌PPX和GppA蛋白[12-13]以及运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的假定外切聚磷酸酶[14]。此结果有利于结构解析时进行晶体空间群的确定。

由PgPPX蛋白的晶体生长条件筛选结果可知，3种条件中均含有20% PEG3350(m/V)，说明该浓度条件下的PEG3350对PgPPX晶体的生长极其重要，而0.2 mol/L MgSO4·6 H2O影响晶体的形状。后续需要采用坐滴法或筛选添加剂等方法依据PEG/ION-32的成分组成对PgPPX晶体进行进一步优化，以期获得衍射能力更好的晶体，为后期对该致病菌中如此重要的外切聚磷酸酶进行结构和功能研究奠定基础，并为基于结构基础的抗牙周炎药物设计提供一个起点。