刘仙俊，张慧珍，王潇潇，李合，李波

（太原科技大学化学与生物工程学院，山西太原030021）

豆类中含有丰富的多酚类、黄酮类等生物活性物质，这些生物活性物质被称为天然抗氧化剂，具有清除人体内多余的自由基，保护机体免受活性氧自由基攻击而导致的人体内脂质过氧化、酶失活、核酸和蛋白质损伤等，能够减缓衰老、增强人体免疫力，并防止人体内发炎、癌变、动脉粥样硬化、糖尿病等疾病的产生[1-13]。

国内外对豆类生物活性物质的研究有很多报道，Singh等研究表明绿豆总多酚的总抗氧化活性、铁还原力和DPPH自由基清除活性都比较好[14]。Zhou等研究发现红刀豆种皮中含有丰富的多酚类物质[15]。Herrera-Hernández研究了墨西哥萨卡特卡斯半干旱条件下生长的大豆，发现其具有丰富的生物活性物质和较强抗氧化能力[16]。曹柏营等研究发现黑豆花青素对铁离子螯合剂和羟基自由基有较高的清除力[17]。巩蔼等研究了云南8种特色豆，表明其具有较高的总多酚含量和较强的抗氧化性能[18]。程安玮等研究表明蚕豆等4种豆类中的结合态多酚具有较高的抗氧化性[19]。王德萍等研究发现鹰嘴豆乙醇提取物具有一定的降血糖作用[20]。任娇艳等研究表明白扁豆水提物对幽门螺杆菌损伤人胃黏膜上皮细胞具有一定的修复作用[21]。

本研究以黑豆、绿豆、红小豆、大豆和豇豆5种豆类为研究材料，比较其乙醇提取物总多酚和总黄酮含量及4种体外抗氧化活性，进行相关性分析，为我国豆类资源的开发利用和豆类保健品的研制提供理论科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑豆、绿豆、红小豆、大豆、豇豆：市售，优质且含水量＜5%。

没食子酸标准品、芦丁标准品：美国Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、福林酚：上海源叶生物科技有限公司，三羟甲基氨基甲烷（Tris）：上海生工生物工程股份有限公司；硫酸亚铁七水合物：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水碳酸钠、水杨酸、抗坏血酸、过氧化氢、浓盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-5200型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；D-37520型台式离心机：德国赛默飞世尔科技公司；FA1004电子分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH-2A型电热恒温水浴锅、FW-200型高速万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司；PHS-3C型酸度计：上海佑科仪器仪表有限公司；DZC-403型真空干燥箱：天津天宇机电仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品溶液的制备

豆类样品于60℃烘干10 h，粉碎成末后过60目筛，准确称取2 g样品粉末，按1∶10（g/mL）的料液比加入体积分数为70%的乙醇溶液，以250 r/min的转速60℃下恒温振荡提取2 h，7 000 r/min离心8 min，取上清液，残渣在相同条件下重复提取1次，合并两次上清液并定容备用，每个样品设3个重复。

1.3.2 豆类中总多酚含量的测定

1.3.2.1 没食子酸标准曲线的绘制

参照文献[22]绘制没食子酸标准曲线，所得线性回归方程：Y=139.39X+0.026，回归系数R2=0.995 3。

式中：Y为吸光度；X为没食子酸标准液浓度，mg/mL。

1.3.2.2 总多酚含量测定

准确吸取1 mL样品溶液于25 mL的具塞试管中；分别加入福林酚试剂1 mL及质量分数为12%的碳酸钠溶液2 mL并定容至刻度线，室温25℃下避光反应2 h；在765 nm波长处测定样品的吸光度，并根据标准曲线和计算公式得出豆类总多酚的含量。总多酚含量的计算公式如下。

式中：P为豆类总多酚含量（以没食子酸计），mg/g；C为根据标准曲线所算得反应液总多酚浓度，mg/mL；V为反应液体积，mL；N为稀释倍数；M为所称取的豆粉质量，g。

1.3.3 豆类中总黄酮含量的测定

1.3.3.1 芦丁标准曲线的绘制

参照文献[23]绘制芦丁标准曲线，所得线性回归方程：Y=10.736X+0.007 1，回归系数R2=0.998 7。

式中：Y为吸光度；X为芦丁标准液浓度，mg/mL。

1.3.3.2 总黄酮含量的测定

准确吸取样品溶液2.0 mL放置于10 mL的容量瓶中；加3 mL体积分数为70%的乙醇溶液，再加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀静置6 min；加入10%的硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀静置6 min；加入4%的氢氧化钠溶液4 mL，再用70%的乙醇定容至刻度，摇匀静置12 min；在510 nm下测定吸光度，并根据标准曲线和计算公式得出豆类总黄酮的含量。总黄酮含量的计算公式如下。

式中：P为豆类总黄酮含量（以芦丁计），mg/g；C为根据标准曲线所算得反应液总黄酮浓度，mg/mL；V为反应液体积，mL；N为稀释倍数；M为所称取的豆粉质量，g。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的测定

准确移取0.5 mL样品溶液于试管内，再取两支空试管，向其中分别加入0.5 mL抗坏血酸溶液（阳性对照）和0.5 mL蒸馏水（空白），然后向各试管分别加入0.004%的DPPH溶液2.5 mL，混合均匀后于37℃恒温避光水浴30 min，冷却至室温25℃，测定波长515 nm处的OD值。

DPPH·清除率/%=[1-（OD样品-OD对照）/OD空白]×100

1.3.5 羟基自由基（·OH）清除能力的测定

取样品溶液0.5 mL置于试管内，再取两支空试管，向其中分别加入0.5 mL抗坏血酸溶液（阳性对照）和0.5 mL蒸馏水（空白），各试管再分别加入0.15 mmol/L FeSO4溶液 1 mL、2 mmol/L 水杨酸 0.4 mL、6 mmol/L H2O2溶液1 mL及蒸馏水0.4 mL，振荡摇匀，37℃下恒温水浴1 h，冷却至室温25℃，测定波长510 nm处的OD值。

·OH 清除率/%=[1-（OD样品-OD对照）/OD空白]×100

1.3.6 超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力测定

取3支干燥洁净的试管分别加入0.2 mol/L的Tis-HCL缓冲液（pH 8.2）4.0 mL，再各加入 0.5 mL样品液、0.5 mL抗坏血酸溶液（阳性对照）和0.5 mL蒸馏水（空白），混匀后，置于25℃恒温水浴，反应4 min后立即加2滴8 mol/L的HCL终止反应，并测定波长为420 nm处的OD值。

O2-·清除率/%=[1-（OD样品-OD对照）/OD空白]×100

1.3.7 过氧化氢（H2O2）清除能力测定

用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）将H2O2配置成40 mmol/L的H2O2溶液，取3支试管分别加入0.6 mL配置好的H2O2溶液，再向其中各加入3.4 mL样品溶液、3.4 mL抗坏血酸溶液（阳性对照）和3.4 mL蒸馏水（空白），混匀，230 nm处测定其OD值。

H2O2清除率/%=[1-（OD样品-OD对照）/OD空白]×100

1.4 数据统计分析

所有处理均重复3次，数值表示为平均值±标准差（SD），采用SPSS 17.0统计软件进行相关性及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 豆类中总多酚和总黄酮含量比较

5种豆类的总多酚和总黄酮含量见表1。

表1 5种豆类中总多酚和总黄酮含量Table 1 The contents of total polyphenols and total flavonoids in five samples

由表1可知，5种不同豆类的总多酚含量存在一定差异，其中黑豆总多酚含量最高，其含量高达6.33mg/g，这可能与黑豆皮中含有比较多的花青素有关，其次是红小豆，总多酚含量为3.73 mg/g，绿豆、大豆和豇豆的总多酚含量较低，在2.05 mg/g～2.18 mg/g范围内，且3者之间的总多酚含量差异不显著（P＞0.05）。

从表1可以看出，5种不同豆类的总黄酮含量也存在一定差异，其中黑豆总黄酮含量最高，为4.09 mg/g，其次为红小豆和豇豆（分别为2.61 mg/g和2.08 mg/g），绿豆和大豆的总黄酮含量较低，且二者之间不存在显著差异（P＞0.05），分别为 1.51 mg/g和 1.50 mg/g。由表1可知，5种豆类的总黄酮含量都低于其总多酚含量，这是可能由于大多数的黄酮类化合物都属于多酚类物质。

2.2 5种豆类的抗氧化活性比较

各种抗氧化成分的抗氧化机理不同[24]，由于不同豆类的抗氧化活性成分及含量有一定差异，所以要研究其抗氧化活性需要综合不同的检测方法，本研究通过对 DPPH·、·OH、O2-·和 H2O2的清除能力来分析5 种豆类的抗氧化活性，具体结果见表2。

表2 5种不同豆类的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of five different samples

2.2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH·是一种非常稳定的自由基，被广泛用于天然成分的体外抗氧化活性研究，在自由基清除剂（如多酚类、黄酮类物质）存在下，其溶液会由深紫色逐渐变为浅黄色或无色，通过观察515 nm处吸光度值的变化就可以计算某物质的DPPH·清除率[25]。

5种不同豆类对DPPH·的清除率见图1。

图1 5种不同豆类对DPPH·的清除率Fig.1 DPPH·clearance rates of five different samples

从表2和图1可以看出不同豆类DPPH·清除率有明显差异，其中清除率最高的是黑豆，高达80.92%，这可能与黑豆中含有较高的总多酚和总黄酮有关，其次是红小豆和绿豆，清除率也比较高，分别为72.21%和72.02%，且二者不存在显著差异（P＞0.05），豇豆和大豆的清除率略低，分别为59.41%和54.54%，且二者差异显著（P＜0.05）。

2.2.2 羟基自由基清除能力

·OH是一种非常重要的活性氧，具有极强氧化性即得电子能力，所以对生物体毒害作用非常强，可以导致细胞损伤和各种疾病[24]。

5种不同豆类对·OH的清除率见图2。

图2 5种不同豆类对·OH的清除率Fig.2·OH clearance rates of five different samples

如表2和图2显示，5种不同豆类·OH清除率具有显著差异（P＜0.05），其中大豆的清除率最高，为87.11%，其次是黑豆、红小豆和绿豆，分别为77.42%、73.25%和69.02%，豇豆的·OH清除率最低，为52.13%。

2.2.3 超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力

O2-·是一种活性氧自由基，可以导致人体内脂质过氧化，加快衰老，并诱发各种皮肤病、癌症和心血管疾病等，严重损害人体健康，O2-·在人体内可以被超氧化物歧化酶和摄入的一些抗氧化剂清除[26]。

5种不同豆类对O2-·的清除率见图3。

图3 5种不同豆类对O2-·的清除率Fig.3 O2-·clearance rates of five different samples

由表2和图3可以看出，5种不同豆类O2-·清除率也存在显著差异（P＜0.05），其中黑豆的清除率最高，高达81.62%，其次是红小豆、豇豆和大豆，分别为75.60%、68.95%和56.98%，绿豆的O2-·清除率最低，为54.57%。

2.2.4 过氧化氢（H2O2）清除能力

按结构划分H2O2并不属于自由基范畴，但其对人体的损伤作用与自由基相似，主要体现在对人体生命大分子的损害，是造成衰老和疾病的重要原因之一[24]。目前体外H2O2清除能力测定的方法主要是分光光度法[24]。

5种不同豆类对H2O2的清除率见图4。

由表2和图4可知，5种不同豆类的H2O2清除率相比前3种自由基的清除率来说都不高，清除率最大的是豇豆，为39.58%，其次为红小豆，清除率38.06%，大豆和黑豆的H2O2清除率差异不显著（P＞0.05），分别为36.79%和36.73%，清除率最低的是绿豆，为35.45%。

2.3 豆类中总多酚、总黄酮含量与抗氧化活性之间的相关性

利用SPSS 17.0统计软件对5种不同豆类总多酚、总黄酮含量及其 DPPH·、·OH、O2-·和 H2O2清除能力之间进行双变量相关性分析，所得Pearson相关系数及双侧显著性检验结果见表3。

图4 5种不同豆类对H2O2的清除率Fig.4 H2O2clearance rates of five different samples

表3 豆类总多酚、总黄酮含量与抗氧化活性之间的相关性Table 3 The coefficients among the contents of total polyphenols，total flavonoids and the antioxidant activity of five samples

由表3可以看出，5种不同豆类的总多酚含量和总黄酮含量呈现极显著正相关（P＜0.01），这可能是由于大多数黄酮类化合物都属于多酚类物质；豆类总多酚含量与DPPH·、·OH和O2-·清除率之间都呈正相关，其中与DPPH·和O2-·清除率之间的相关性比较高；豆类总黄酮含量和四种抗氧化活性之间都呈正相关，其中与 O2-·清除率之间呈显著正相关（P＜0.05），与DPPH·清除率的相关性也比较高。

3 结论

对黑豆、绿豆、红小豆、大豆和豇豆5种豆类的总多酚、总黄酮含量进行分析。结果表明，5种不同豆类的总多酚含量在2.05 mg/g～6.33 mg/g的范围内，总黄酮含量在1.50 mg/g～4.09 mg/g的范围内，其含量在不同豆类间存在明显差异，其中黑豆的总多酚和总黄酮含量都最高，分别为6.33 mg/g和4.09 mg/g。

采用4个指标对4种豆类进行分析，结果发现不同豆类对 DPPH·、·OH、O2-·和 H2O2的清除能力存在明显差异，这可能是由于不同豆类所含的抗氧化成分不同，以致其抗氧化机理也不尽相同。5种豆类对DPPH·、·OH和O2-·的清除率都比较高，其中黑豆的清除力最强，对3种自由基的清除能力分别为80.92%、77.42%和81.62%。

相关性分析表明5种豆类的总多酚和总黄酮含量之间呈极显著正相关（P＜0.01），这可能是由于大多数黄酮类化合物都属于多酚类物质。这两种活性成分含量与DPPH·、·OH和O2-·清除能力之间都呈正相关，其中总黄酮含量和O2-·清除能力之间呈显著正相关（P＜0.05）。

综上，5种豆类含有丰富的多酚类和黄酮类物质，并具有较强的抗氧化性能，这将为豆类保健品的研制和天然抗氧化剂的开发利用提供参考。