李彦坡，邹盈，李群和，王罗其，郑晓杰*

温州市农业科学研究院（温州 325006）

青钱柳（Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja）又名摇钱树，是我国特有的珍稀植物，广泛分布于浙江、江西、湖南、湖北等海拔为400～1 800 m的湿润山地常绿林中。青钱柳叶味甘甜，具有清热消肿、止痛等功效，多项研究表明，青钱柳叶具有降血糖、降血压、降血脂等生物活性，被民间称为“降糖神茶”[1-3]。青钱柳多糖被认为是青钱柳叶中主要有效成分之一，已报道的文献中，青钱柳多糖提取主要为水提法[4-6]、微波法[7]与超声波辅助提取法[8-9]，采用超声波、微波、酶等方法辅助提取，可缩短提取时间，提高产品得率。常规提取方法易破坏有效成分的生物活性，提取时间长，而采用低温浸泡则溶媒用量大、耗时长、回收成本高[10]。超高压提取技术在有效成分提取方面具有许多独特优势，如提取率高、耗时、耗能少，产物活性高，并且在密闭环境下进行，没有溶剂挥发，不会对环境造成污染，符合绿色环保要求，对多糖结构基本无影响。相对于传统热水提取，超高压提取可明显提高多糖的提取率，可较大程度保留多糖活性[11-13]。超高压提取青钱柳多糖的报道较少[14]，对于超高压提取工艺及其对多糖的结构和活性的影响仍鲜见报道。试验应用超高压提取青钱柳叶多糖，获得其最优工艺，并测定青钱柳粗多糖抗氧化活性，以期为青钱柳多糖提取研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

青钱柳干叶（文成县圣山食品开发有限公司）。

1.1.2 试剂

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）；葡萄糖、石油醚、无水乙醇、苯酚、纯硫酸、抗坏血酸、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸（均为国产分析纯）。

1.1.3 仪器与设备

YB-600A型高速多功能粉碎机（永康速锋工贸有限公司）；5 L型超高压设备（温州滨一机械厂）；TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；TGL-16M离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 青钱柳多糖超高压提取工艺

干燥的青钱柳叶粉碎，过40目筛。按料液比1︰10（g/mL）的比例加入石油醚（沸程60～90 ℃），回流1 h脱脂，脱脂后过滤，滤渣烘干进行后续试验。按料液比1︰3（g/mL）加入无水乙醇，在80 ℃水浴中加热回流，以除去小分子醇溶物，过滤，所得滤渣干燥备用。将脱脂脱醇溶物后青钱柳粉末按一定料液比装入聚乙烯复合袋中，排除空气密封，置入超高压装置中进行超高压处理，卸压后过滤，加入3倍体积无水乙醇，以8 000 r/min离心10 min后取上清液，测定青钱柳多糖含量[15-16]。

1.2.2 超高压提取青钱柳多糖单因素与正交试验设计

以青钱柳多糖得率为考察指标，进行超高压提取青钱柳多糖单因素试验，研究各因素对超高压提取效果的影响。在单因素试验的基础上，选取对提取效果影响显著的因素进行多因素正交试验，获得超高压提取青钱柳多糖最佳工艺参数。

1) 不同料液比对超高压提取多糖得率的影响

设置超高压提取温度25 ℃，提取时间30 min，压力300 MPa，料液比分别为1︰10，1︰15，1︰20，1︰25和1︰30（g/mL）提取青钱柳多糖，提取后过滤，对滤液进行多糖含量测定，研究提取料液比对多糖提取得率的影响。

2) 不同超高压处理提取时间对青钱柳多糖提取得率的影响

将样品于超高压处理温度25 ℃，压力300 MPa，料液比1︰20（g/mL）条件下，分别提取30，45，60，90和120 min，处理完成后过滤，测定滤液中多糖含量，研究不同提取时间对多糖提取得率的影响。

3) 不同提取温度对多糖提取得率的影响

设定超高压提取压力300 MPa，料液比1︰20（g/mL），提取时间60 min，分别在20，30，40，50和60℃温度下进行提取，提取完成后过滤样品，测定滤液中青钱柳多糖含量，研究不同提取温度对多糖提取得率的影响。

4) 不同超高压处理压力对多糖提取得率的影响

设定超高压提取青钱柳多糖的料液比1︰20（g/mL），提取时间60 min，提取温度40 ℃，分别在200，300，400，500和600 MPa压力下进行提取，提取完成后过滤样品并多糖含量，研究不同提取压力对多糖提取得率的影响。

5) 正交试验优化超高压提取工艺条件

根据单因素试验结果，以提取料液比、温度及超高压压力为因素进行四因素三水平正交试验设计（表1），以获得超高压提取青钱柳多糖最优工艺参数。

表1 正交试验因素水平表

1.2.3 青钱柳多糖的测定

1) 标准曲线的绘制

准确称取干燥恒质量的葡萄糖标准品，配制成1 mg/L葡萄糖标准溶液，准确吸取10 mL，用蒸馏水稀释定容至100 mL，即得100 μg/mL葡萄糖标准溶液。取9支干净具塞试管按表2方法操作，先在冰水浴中加入0.5 mL的90%，6%苯酚溶液，摇匀后缓慢加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞，在沸水中放置20 min，取出凉水冷却10 min，0号为空白，在最大吸收波长处（490 nm）测定吸光度。以葡萄糖质量浓度X为横坐标（μg/mL），吸光度Y为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线（图1）[17]。

表2 标准曲线绘制加样表

图1 葡萄糖标准曲线

2) 多糖含量测定

预处理后的青钱柳叶经超高压提取、过滤后定容到200 mL，取2 mL定容后的溶液加入6 mL无水乙醇，以8 000 r/min离心15 min。取沉淀用蒸馏水溶解定容至100 mL。准确吸取该溶液0.5 mL进行显色，在490 nm下测定其吸光度，根据所得回归曲线方程计算多糖得率。

1.2.4 青钱柳多糖抗氧化活性测定

1) DPPH·活性清除

将1 mg/mL样品溶液用无水乙醇分别稀释成质量浓度为2，4，6，8和10 mg/mL溶液。分别取3 mL上述溶液于试管中，加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH·溶液，混匀后避光静置1 h，在517 nm处测定吸光度（用原溶剂作参比）。同时将3 mL溶剂（无水乙醇）与2 mL 0.2 mmol/L的DPPH·溶液混合，测定其在517 nm处的吸光度。以抗坏血酸为阳性对照，临用前用去离子水配制成与待测物溶液同等浓度的对照液。蒸馏水做空白对照[17]。

按照式（2）计算不同浓度待测物的DPPH自由基清除率。

式中：Ai为3 mL样品溶液+2 mL DPPH·溶液；Aj为3 mL样品溶液+2 mL无水乙醇；Ac为3 mL无水乙醇+2 mL DPPH·溶液。

2) ·OH清除活性

将待测物用无水乙醇分别稀释成浓度0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL的溶液，取1 mL上述待测物溶液于试管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L水杨酸乙醇溶液1 mL，最后加入8 mmol/L的H2O2溶液1 mL以启动反应，37 ℃水浴加热30 min后终止反应，于510 nm测定吸光度。以抗坏血酸为阳性对照，临用前用去离子水配制成与试验待测物溶液同等浓度的对照液，蒸馏水做空白对照[18]。

式中：Ax为1 mL样品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水杨酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液；Ax0为1 mL样品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水杨酸乙醇溶液+1 mL无水乙醇；A0为1 mL蒸馏水+1 mL FeSO4溶液+1 mL水杨酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液。

2 结果与讨论

2.1 不同料液比对超高压提取多糖得率的影响

固定其他因素不变，采用不同料液比进行超高压提取青钱柳多糖试验，研究不同料液比对超高压提取青钱柳多糖的影响，其结果如图2。

随着料液比增加，青钱柳多糖得率逐渐增大，同时对不同料液比提取青钱柳多糖得率结果进行方差分析（如表3）可知，不同料液比对青钱柳多糖得率结果影响显著，随着料液比增加，青钱柳多糖多率提高，但考虑到料液比增加给青钱柳多糖分离和后期干燥成本增大，综合考虑，选取料液比1︰20（g/mL）进行后续试验。

2.2 超高压处理时间对青钱柳多糖提取得率的影响

其他因素不变，改变超高压条件下青钱柳提取时间，研究不同处理时间对青钱柳多糖提取得率的影响，结果见图3。

随着超高压保压提取时间延长，青钱柳多糖提取率呈现出轻微增加趋势，主要是由于随着提取时间增加，青钱柳多糖进入提取液中也随之增加，但从图3及表4方差分析表中可知，超高压提取时间的变化对青钱柳多糖提取得率的影响不显著，这可能是与超高压提取机制有关。超高压提取的主要原理是通过使细胞内外渗透压力突然增大，细胞内有效成分穿过细胞转移到细胞外的提取液中，达到提取目的，而时间相对来说影响不大，随着时间延长，提取率逐渐趋于不变。

图2 料液比对青钱柳多糖得率的影响

表3 方差分析表

图3 超高压提取时间对青钱柳多糖得率的影响

表4 方差分析表

2.3 不同提取温度对多糖提取得率的影响

控制超高压处理腔中水的温度从而达到控制提取温度的目的。不同提取温度对青钱柳多糖提取得率的影响结果见图4。

随着提取温度升高，青钱柳多糖得率有先提高后降低趋势，提取温度40 ℃时，青钱柳多糖的提取得率最高。对单因素试验结果进行方差分析可知，提取温度对青钱柳多糖提取率影响显著，高温提取反而不利于青钱柳多糖溶出。

图4 提取温度对青钱柳多糖得率的影响

表5 方差分析表

2.4 超高压提取压力对青钱柳多糖提取得率的影响

不同超高压处理压力对青钱柳多糖提取得率的影响结果见图5。

压力是超高压提取过程中的重要影响因素，表6方差分析可证明压力对青钱柳多糖提取得率影响显著。由图5可知，随着处理压力升高，青钱柳多糖的提取率逐渐升高，至500 MPa时提取得率最高，而随后变化不大。

图5 提取压力对青钱柳多糖提取得率的影响

表6 方差分析表

2.5 正交试验优化超高压提取工艺条件

根据单因素试验结果及单因素试验方差分析，剔除对青钱柳多糖得率影响不显著的因素，确定以提取液料比、提取温度及超高压压力进行四因素三水平的正交试验，获得超高压提取青钱柳多糖最佳工艺参数。正交试验结果如表7。

正交试验可知，青钱柳提取多糖的最佳工艺为A3B1C2，即最佳提取工艺参数为：料液比1︰25（g/mL），温度30 ℃，提取压力500 MPa。在此最佳条件下，青钱柳多糖得率为3.70%。

表7 超高压萃取青钱柳多糖工艺正交试验结果

2.6 抗氧化活性测定结果

2.6.1 DPPH·清除活性测定结果

DPPH·具有单一电子，所以能接受一个电子或氢离子，其乙醇溶液呈紫色，在波长517 nm下具有最大吸收。自由基清除剂存在时，DPPH·单电子被配对从而吸收消失或减弱，颜色从紫色逐渐变成黄色，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速定量分析，间接评价该自由基清除剂活性。抗氧化能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化能力越强。体外测定的青钱柳多糖对DPPH·清除效果见图6青钱柳多糖对自由基的清除能力，可看出青钱柳多糖的清除DPPH自由基活性总体上小于阳性对照VC，但其清除DPPH自由基活性随样品浓度增加而增大，青钱柳质量浓度从16.125 μg/mL增加到250 μg/mL时，其清除DPPH自由基能力迅速增加，达到93%，但与VC清除率仍有差距（99.9%）。青钱柳多糖对DPPH·清除效果与吴菲菲等、应瑞峰等和葛霞等研究结果一致[19-22]，但通过比较其提取的青钱柳多糖的清除自由基能力，相对于超声波提取及水提醇沉及沸水浴等方法提取青钱柳多糖，超高压提取的青钱柳粗多糖的DPPH·清除能力93%比超声波提取的青钱柳多糖清除能力更强，青钱柳多糖浓度更低，这与超高压提取技术的低温、短时、对多糖活性破坏小等优点相关。

2.6.2 ·OH清除活性测定结果

和其他自由基相比，羟自由基是体内最活跃的活性氧自由基，产生于生命活动的氧化代谢过程，可使氨基酸、蛋白质、脂肪类和核酸等大分子发生氧化损伤，诱导细胞凋亡或使转化细胞脱离正常细胞的控制无限生长而癌变，由图7可以看出，青钱柳多糖对羟自由基有一定清除活性，最高清除率是50.3%。维生素C质量浓度在0.4～1.0 mg/mL时，清除活性均在90%以上，由此看出青钱柳多糖的清除羟自由基的能力远远小于阳性对照维生素C。这与吴菲菲等、葛霞等和胡红忠[19,21-22]的研究结果一致，而相对于不同提取方法，超高压提取则没有表现出明显区别。

图6 青钱柳多糖对DPPH自由基的清除能力

图7 青钱柳多糖对羟自由基的清除活性

3 结论

通过单因素与正交试验获得最优超高压提取青钱柳多糖工艺参数，同时对得到青钱柳多糖进行抗氧化活性测定，结果表明，青钱柳多糖最佳提取条件为料液比1︰25（g/mL），提取温度30 ℃，提取压力500 MPa，此时得率最高，为3.70%。超高压提取的青钱柳叶多糖具有一定抗氧化能力，对DPPH自由基有较好清除作用，且相对于其他提取方式，其活性较高这为青钱柳多糖的高效、高活性提取提供参考，但超高压提取对青钱柳多糖的具体成分变化尚不清楚，有待进一步研究。