(广州中医药大学,广东广州 510006)

高尿酸血症(Hyperuricemia,HUA)是由于嘌呤代谢异常或尿酸排泄减少所引起的代谢性疾病,以血尿酸升高为主要特征[1-2]。尿酸(Uric acid,UA)是人体嘌呤核苷酸代谢的终产物,主要经肝脏中广泛分布的黄嘌呤氧化酶(XOD)催化合成,再经肾脏排泄[3]。研究表明,长期的高尿酸症状对血管、心脏、肝脏、肾脏均会产生一定的损害,与高血压病、高脂血症、肥胖及胰岛素抵抗等代谢综合征的发生与发展密切相关[4-6],故高尿酸血症已成为威胁人类健康的重要疾病之一,且随着人们生活水平的提高和膳食模式的改变,高尿酸血症的发病率日益增高。目前临床上治疗高尿酸血症主要是通过增加尿酸排泄或抑制XOD 活性,最常用的药物主要有别嘌呤醇(Allopurinol)等XOD抑制剂,其通过治疗尿酸过量以降低尿酸水平,但服用别嘌呤醇的患者只有不到40%可将血清尿酸浓度降低至目标水平,且长期服用会导致肝肾损害[7-8]、过敏、骨髓抑制、胃肠道反应等[9-11],在一定程度上限制了临床应用。而中医药治疗高尿酸血症经验丰富,疗效可靠,对人体副作用小[12-14]。因此,寻找替代或增效的药物,中药可能是今后降尿酸研究的方向。

姜黄素是一种天然的疏水多酚,来源于姜黄的根状茎,一直被作为调味品及食品添加剂而为大众熟知,目前发现其具有多种药理作用,尤其是在抗炎、抗氧化及促进伤口愈合等方面,在抗肿瘤、抗氧化应激方面已得到广泛的应用。有研究表明,姜黄素可通过下调TGF-β1和NF-κB的表达发挥肾脏保护作用;通过抑制果糖造模的HUA小鼠JAK-STAT的激活及TGF-β1的过表达,上调肾脏NO水平,起到改善肾脏内皮功能障碍和提高尿酸转运蛋白能力的作用及抑制尿酸盐阴离子转运体,促进UA排泄等作用[15]。但目前关于姜黄素的降尿酸、抗炎作用尚未充分挖掘和利用,本研究拟通过氧嗪酸钾诱导建立小鼠高尿酸血症模型,通过测定小鼠血清中UA及XOD、AST及ALT、CRE及BUN的变化,探讨姜黄素对高尿酸血症小鼠降尿酸以及其对肝肾的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性昆明种小鼠(体重18～22 g) 广东省医学实验动物中心(许可证号:SYXK(粤)2018-0085),动物饲养在特定的无特殊病原体(SPF)的条件下,温度维持在20～25 ℃,每日12 h光照,相对湿度50%～80%,普通饲养;姜黄素(>98%)、氧嗪酸钾(97%)、别嘌呤醇 美国Sigma化学公司;尿酸、黄嘌呤氧化酶(XOD)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转移酶(ALT)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)检测试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1510全波长酶标仪、Fresco 70冷冻高速离心机 德国Thermo Fisher公司;RB-200智能热板仪 成都泰盟软件公司。

1.2 实验方法

1.2.1 镇痛实验

1.2.1.1 热刺激法-热板刺激法制备小鼠疼痛模型 选取预实验痛阈值符合实验要求(5～30) s的30只小鼠适应性饲养3 d后,随机分为5组,每组6只。根据人体推荐药物剂量范围确定姜黄素给药剂量分为空白组、姜黄素四个剂量组A1(170 mg·kg-1)、A2(85 mg·kg-1)、A3(42.5 mg·kg-1)、A4(21.3 mg·kg-1)。姜黄素以超微粉颗粒经由加热超声溶解达到水中均相。空白组给予蒸馏水(0.1 mL/10 g),其它各组每天给药1次,连续灌胃5 d。各组小鼠给药前测定基础痛阈值,待智能热板仪调至(55±0.1) ℃后,将小鼠放入铅罐中,观察其开始出现舐后足的时间,则该时间为小鼠的热痛反应时间,即痛阈值。在末次给药2 h后再次测定各组给药后痛阈值。通过比较姜黄素各剂量组给药前后小鼠痛阈值的变化,确定姜黄素的镇痛最佳剂量[16]。

1.2.1.2 化学刺激法-醋酸刺激法制备小鼠疼痛模型 分组同1.2.1.1,末次给药2 h后腹腔注射0.6% 醋酸(0.15 mL·10 g-1)。记录小鼠20 min内的扭体次数和开始出现扭体的时间。根据扭体次数的多少,确定姜黄素镇痛作用的强弱及最佳剂量[17-18]。

1.2.2 姜黄素对氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠的作用

1.2.2.1 小鼠高尿酸血症模型建立与给药 选取48只小鼠,适应性饲养3 d后,随机分为4组,分别为空白组、模型组、别嘌醇阳性组(allopurinol,APL,5 mg·kg-1)、姜黄素组(85 mg·kg-1),每组12只。给予普通饲料、纯水,自由饮食。其中模型组、别嘌醇阳性组、姜黄素组以氧嗪酸钾(PO)300 mg·kg-1(i.p)建立高尿酸血症模型,溶剂为0.5%羧甲基纤维素钠(sodium carboxyl methyl cellulose,CMC-Na),连续注射15 d;空白组注射0.5%CMC-Na溶剂(0.2 mL/10 g)[19-20]。造模成功后,别嘌醇阳性组与姜黄素组每天给药1次(0.1 mL/10 g),连续灌胃15 d,空白组及模型组予等体积蒸馏水灌胃。

1.2.2.2 肝、肾系数及相关酶活测定 末次给药后禁食24 h,次日小鼠水合氯醛麻醉下眼眶后静脉丛采血,全血于3500 r/min(-4 ℃)低温离心15 min,吸取上层血清-20 ℃保存,用于后续各指标检测。随后于冰台上快速取出肝脏与肾脏,精密称重,计算肝肾系数,4%多聚甲醛溶液固定后用石蜡包埋,通过HE染色进行病理组织学检查。按照试剂盒说明书操作测定各组小鼠血清中尿酸(UA)及黄嘌呤氧化酶(XOD)、谷草转氨酶(AST)及谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(CRE)及尿素氮(BUN)的含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 镇痛实验

2.1.1 热刺激法-热板刺激法制备小鼠疼痛模型 热板刺激法是基于小鼠足部温度感受器接受热刺激后将信息传到高位中枢,并在其参与下完成的躯体缩爪反应,该方法简便易行,且对实验动物损伤较小[21]。从表1可知,用药前基础痛阈测定,空白组、姜黄素各组比较差异无统计学意义(P>0.05)。同空白对照组对比,姜黄素A1、A2组均能使小鼠痛阈值延长,其中A2组给药后痛阈值由(18.7±2.6) s延长到(23.6±2.7) s,差异极显著(P<0.01);表明姜黄素具有镇痛作用,且85 mg·kg-1为姜黄素发挥镇痛作用最佳剂量。

表1 各组小鼠痛阈值变化情况Table 1 Changes of pain threshold in mice of each group

2.1.2 化学刺激法-醋酸刺激法制备小鼠疼痛模型 从表2可知,同空白对照组相比,姜黄素各给药组能减少小鼠扭体次数,差异具有显著性(P<0.05,P<0.01),且A2、A4组还可极显著延长扭体潜伏期(P<0.01),A2组较A4组作用更明显。表明姜黄素有显著镇痛效果,且85 mg·kg-1为姜黄素发挥镇痛作用的最佳剂量。

表2 姜黄素对冰醋酸致小鼠扭体反应次数影响Table 2 Effects of curcumin on the number of writhing reactions induced by glacial acetic acid in mice

疼痛是高尿酸血症痛风的典型特征,以镇痛实验确定姜黄素镇痛最佳剂量,结果表明姜黄素有显著镇痛效果,85 mg·kg-1为姜黄素发挥镇痛作用的最佳剂量。

2.2 姜黄素对氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠的作用研究

2.2.1 姜黄素对高尿酸血症小鼠肝肾系数的影响 由表3可知,同空白组比较,模型组肝肾系数极显著增加(P<0.01),表明氧嗪酸钾造模后,持续的高尿酸可引起肝肾损伤。同模型组比较,阳性药别嘌醇组肝肾系数有极显著性降低(P<0.01),姜黄素组显著降低肝系数(P<0.05),肾系数极显著降低(P<0.01)。

表3 小鼠肝肾系数Table 3 Liver and kidney coefficient in mice

2.2.2 姜黄素对高尿酸血症小鼠血清中尿酸(UA)及黄嘌呤氧化酶(XOD)含量的影响 XOD是黄嘌呤氧化还原酶的一种,广泛分布于哺乳动物中,在肝脏中浓度较高,对次黄嘌呤和黄嘌呤的氧化有催化作用[22-24]。高尿酸血症患者体内由于肝脏代谢活动增强,导致肝细胞细胞膜的通透性增加,使得血清中XOD的含量与体内XOD的含量呈现一定的数量关系[25]。因此血清XOD的活性可作为检测指标来说明小鼠体内XOD的活性,从而反映药物降尿酸的作用。由表4可知,同空白组比较,模型组尿酸及黄嘌呤氧化酶含量极显著升高(P<0.01),表明高尿酸血症模型造模成功。与模型组比较,阳性药组、姜黄素组的尿酸及黄嘌呤氧化酶含量极显著下降(P<0.01),表明姜黄素具有较强的降尿酸能力。

表4 小鼠血清中尿酸(UA)及黄嘌呤氧化酶(XOD)含量Table 4 Expression of UA and XOD in serum of mice with hyperuricemia

2.2.3 姜黄素对高尿酸血症小鼠血清中谷草转氨酶(AST)及谷丙转氨酶(ALT)含量的影响 ALT和AST是临床上最常用的肝酶指标。ALT存在于肝细胞的胞质中,特异性较高,一旦肝细胞出现变性,膜通透性增加,血清ALT水平也随之升高,可反映肝脏的损伤情况;AST多存在于心、肾、肝等部位,一旦肝脏受损严重,线粒体中将逸出AST,可有效反映肝细胞的损伤情况[26]。由表5可知,同空白组比较,模型组中谷草转氨酶、谷丙转氨酶的含量极显著升高(P<0.01),表明持续的高尿酸可引起肝脏损伤。与模型组比较,阳性药组、姜黄素组中谷草转氨酶及谷丙转氨酶的含量显著下降(P<0.05),表明姜黄素有一定的肝损伤防治作用。

表5 小鼠血清中谷草转氨酶(ALT)及谷丙转氨酶(AST)含量Table 5 Expression of ALT and AST in serum of

图1 姜黄素对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠肝肾的影响(200×)Fig.1 Effects of curcumin on the influence of liver and kidney in hyperuricemia mice induced by potassium oxonate(200×)注:△:细胞水肿;□:炎症浸润;◇:肾小管扩张。

2.2.4 姜黄素对高尿酸血症小鼠血清中肌酐(CRE)及尿素氮(BUN)含量的影响 血清CRE和BUN是临床诊断和评估肾脏损伤的常用指标,二者均通过肾脏代谢,当肾脏受损时其水平明显升高,可有效反映肾功能受损程度。由表6可知,同空白组比较,模型组中尿素氮、肌酐的含量极显著升高(P<0.01),表明持续的高尿酸可引起肾脏损伤。与模型组比较,阳性药组、姜黄素组中肌酐及尿素氮极显著下降(P<0.01),表明姜黄素在保护肾功能上有一定功效。

表6 小鼠血清中肌酐(CRE)及尿素氮(BUN)含量Table 6 Expression of CRE and BUN in serum of mice with hyperuricemia

2.2.5 小鼠肝肾组织病理变化 由图1可知,模型组小鼠肝脏中部分细胞水肿,肝小体边界不明显,周围有明显的炎症浸润;肾脏中肾小管扩张,炎症浸润明显。与模型组相比,别嘌醇组、姜黄素组中肝组织表现为肝小体、肝小叶相对完整,炎症浸润相对减少;肾中肾小管扩张数目减少,炎症浸润减少。

3 结论

研究结果表明姜黄素对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠具有较好的降尿酸及肝肾保护作用。姜黄素可下调高尿酸血症小鼠的肝肾系数,降低小鼠血清中UA及XOD含量,改善高尿酸引起的肝肾损伤;姜黄素组小鼠血清ALT、AST、CRE、BUN含量显著降低,肝肾病理图显示姜黄素组中肝肾组织均有不同程度的改善,表现为肝小体、肝小叶相对完整,细胞水肿面积缩小,炎症浸润相对减少;肾小管肿大减少,炎症浸润相对减少,表明姜黄素在保护肝肾上疗效显著。本研究发现姜黄素可显著降低高尿酸血症小鼠血清尿酸,并有保护肝肾的作用,但其作用机制还需进一步的探索研究,本实验可为新药研发提供实验基础。