黄卓林,张 静,宋贤良

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

我国的果蔬种植面积和产量均居世界之首。但是由于储运保鲜技术不完善,我国每年果蔬损失超过25%[1]。果蔬腐烂是造成其损失的重要原因,主要包括生理[2]、微生物[3]和化学[4]三方面。目前广泛采用的果蔬贮藏技术有低温贮藏法、气调贮藏法、辐射贮藏法、生物技术保鲜、微生物拮抗保鲜、臭氧离子贮藏法及涂膜剂保鲜法等[5-6]。上述方法主要是通过抑制微生物及酶的活性进而延长果蔬的保鲜期。其中,以淀粉为原料的涂膜保鲜法具有方法简便、成本低、绿色环保等优势[7-9],并且涂膜层具有较好的选择透气性、阻水性,在一定程度上可以抑制采后水果在贮藏过程中的呼吸作用和蒸腾作用,减少果蔬自身营养物质的消耗和水分的减少。

淀粉是微生物繁殖的天然培养基,因此需添加适宜的抑菌材料增强淀粉膜的抗菌性能[10]。以TiO2为代表的半导体光催化抑菌材料具有安全、稳定性好[11]、广谱抗菌、可重复利用等优点[12-13],但因其带隙较宽,只能在紫外光照射的条件下才能被激发[14-15]。非金属元素掺杂改性纳米TiO2不仅克服了其宽带隙的缺点,将TiO2的光响应范围拓宽到可见光区域[6],同时也可以改善淀粉膜的机械性能[16-17]。目前采用N、S改性纳米TiO2与淀粉复合构筑具有抗菌和保鲜功能的复合膜的研究尚未见有报道。

本文采用非金属元素N、S对纳米TiO2进行改性得到N-TiO2和S-TiO2可见光催化材料,并将改性后的光催化材料通过内部掺杂法负载到淀粉膜上,得到N、S改性TiO2/淀粉复合膜。研究粉体光催化材料及其淀粉复合膜对大肠杆菌的抑菌效果以及复合涂膜对圣女果的保鲜作用,以期为新型涂膜保鲜材料的研究开发提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌(O78) 由华南农业大学微生物实验室提供;纳米TiO2粉(平均粒径21 nm) 德国Degussa公司;玉米淀粉(食品级) 黄龙食品工业有限公司;圣女果 超市(广州五山);氯化钠、氢氧化钠、草酸、脲、硫脲、乙醇、Tris碱干粉、乙酸、乙二胺四乙酸以及配制LB固体培养基所需的琼脂粉、酵母浸膏、胰蛋白胨等 均为国产分析纯。

D8 ADVANCE型X射线多晶衍射仪 德国Bruker公司;XL-30-ESEM型环境扫描电子显微镜 荷兰FEI公司;VERTEX 70傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker公司;752N紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;SW-CJ-IFD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;E27-白光6400K85W国能三基色节能灯 普王科技照明电器厂;DX-35BI座式自动电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;JJ-2组织捣碎匀浆机 金坛市恒丰仪器厂;FZ-A型辐照计 北京师范大学光电仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 N、S掺杂改性TiO2材料的制备 称取两份2 g的TiO2粉末分别与8 g脲和5.7 g硫脲粉末混合,用玛瑙研钵充分研磨后在400 ℃的马弗炉中煅烧3 h,冷却、研磨后,得N-TiO2和S-TiO2粉末。将制备的N-TiO2和S-TiO2粉末进行XRD与FTIR测试。

1.2.2 表征方法 通过X-射线衍射(XRD)、傅里叶红外光谱(FTIR)等技术表征TiO2、N-TiO2和S-TiO2的晶型结构和化学键。

1.2.2.1 XRD测试条件 Cu靶,Kα射线,λ=0.15405 nm,扫描速度5 °/min,扫描范围2θ=20°～90°,管电压为40 kV,管电流30 mA。

1.2.2.2 晶粒尺寸计算 根据XRD分析结果并通过Scherrer公式晶体尺寸对TiO2、N-TiO2和S-TiO2的晶粒尺寸(D)进行估算。

式中:D为晶粒垂直于晶面方向的平均厚度(nm)；β为样品衍射峰半高宽度；θ为衍射角；λ为X射线波长。

1.2.2.3 FTIR测试条件 将干燥后的待测样品与KBr粉末混合均匀后压片,置于样品架中,以空气为背景,扫描范围为400～4000 cm-1,分辨率为2 cm-1。

1.2.3 淀粉复合膜的制备 淀粉复合膜的制备参照宋贤良等[12]的方法:在50 mL蒸馏水中分别加入0.3 g的TiO2、N-TiO2和S-TiO2粉末,超声波分散30 min后得到A液;在50 mL蒸馏水中加入5 g的玉米淀粉和0.3 g的卡拉胶,搅拌分散均匀后得B液;将A、B液混合后加入1.6 g的甘油为增塑剂。在85 ℃条件下水浴搅拌加热15 min至糊化;流延法涂膜(12 cm×10 cm的玻璃模板)后置于50 ℃的烘箱中干燥,取出自然冷却8～12 h,揭膜后裁成直径为1.5 cm的圆片,紫外灯下灭菌30 min后备用。

1.2.4 TiO2、N-TiO2、S-TiO2光催化抑制大肠杆菌实验 无菌条件下,在8 mL生理盐水的试管中加入1 mL浓度为105CFU/mL的大肠杆菌菌悬液,再分别加入1 mL浓度为10 g/L的TiO2、N-TiO2、S-TiO2悬浊液为样品组,以加入1 mL蒸馏水的试管作为空白组,黑暗处理的为无光照组。用涡流振荡器将材料和菌液混合均匀,然后转移至带有普通荧光灯的反应器中,控制光源距反应器中液面的距离为8 cm(实际测得光照强度4.40 mW/cm2)。每20 min取样100 μL,涂布培养,3次重复,18 h后计数、拍照并计算抑菌率。将光照反应100 min后的大肠杆菌菌液经离心、固定、漂洗、脱水、干燥、喷金等处理后置于扫描电镜下观察(加速电压为20 kV)。

1.2.5 淀粉复合膜抑制大肠杆菌实验 无菌条件下取100 μL浓度约为105CFU/mL的大肠杆菌悬液至LB固体培养基上,涂布均匀。将1.2.3中制备得到的TiO2、N-TiO2和S-TiO2/淀粉复合膜贴在已涂布大肠杆菌的培养基后,开始光照处理,每隔一段时间将平板取出倒置于生化培养箱中37 ℃黑暗培养(间隔取样时间为:第1 h内30 min/次,其余时间1 h/次),待菌落长出后测量抑菌圈的直径并对实验终点的抑菌情况进行拍照。

1.2.6 圣女果保鲜涂膜 按照1.2.3中淀粉复合膜的制备方法分别制备TiO2、N-TiO2和S-TiO2的涂膜液,加热糊化后冷却备用。

挑选市售的无机械损伤、无病虫害、大小均匀、成熟度基本一致的圣女果,洗净、擦干。将干燥洁净的圣女果放入上述涂膜液中,圣女果表面被膜液均匀涂布后捞出,室温下晾干。根据涂膜液的不同,将圣女果分为TiO2组、N-TiO2组和S-TiO2组,无膜组不进行任何涂膜处理,空白膜组为涂膜液中只含玉米淀粉、卡拉胶和甘油。将无膜组和涂膜处理后的圣女果放入培养箱(27±2 ℃)中光照处理。测定涂膜圣女果在8 d内失重率、腐烂率、维生素C含量、总酸含量以及总糖含量的变化。

1.2.8 腐烂率测定 分别记录贮藏第1 d圣女果数量n0与不同贮藏时间内的烂果(观察圣女果霉变、病变、腐烂情况,全果可食部分少于4/5时为烂果)数量nt,按下式求出腐烂率。

1.2.9 失重率测定 测定每一个样品在取样时间的重量mt(g)以及初始质量m0(g),按下式计算失重率。

1.2.10 维生素C含量的测定 参照GB 5009.86-2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》[18]。

1.2.11 总酸含量的测定 参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》[19]。

1.2.12 总糖含量的测定 圣女果中总糖含量的测定采用DNS比色法。其中,葡萄糖标准曲线的绘制按田晓菊[20]的方法,所测得曲线为y=1.632X-0.0026,R2=0.9999。

样品预处理:准确称取2 g圣女果果浆,放入250 mL三角瓶中,加15 mL蒸馏水及10 mL 6 mol/L的盐酸,置于70 ℃恒温水浴中水解30 min。待三角瓶中的水解液冷却后过滤,加入2～3滴酚酞指示剂至滤液中,用6 mol/L的NaOH中和至微红色,用蒸馏水定容在200 mL容量瓶中,混匀,作为总糖待测液。

参照GB 5009.7-2016《食品安全国家标准食品中还原糖含量的测定》中的方法测定还原糖含量。

1.3 数据处理

每组实验重复三次,使用Jade 6.5对样品的X射线衍射图谱进行分析,使用Origin 9.1处理实验数据及绘图。

2 结果与分析

2.1 X射线衍射分析

图1是TiO2、N-TiO2和S-TiO2的XRD分析结果,与标准品对比,TiO2、N-TiO2和S-TiO2在2θ=25.28°、48.05°以及55.06°分别出现明显的二氧化钛锐钛矿特征衍射峰,在2θ=27.54°、36.06°、41.32°以及54.28°出现金红石相的特征衍射峰,表明样品由锐钛矿相和金红石相组成。N-TiO2和S-TiO2的XRD并没有出现N和S元素的特征衍射峰,这表明N和S掺杂并不会引起TiO2晶体结构的改变[21]。与TiO2相比,N-TiO2和S-TiO2的衍射峰强度有所下降,且衍射峰位置有所移动,表明N、S元素掺杂进入TiO2中[22]。按1.2.2.2中方法测得TiO2、N-TiO2和S-TiO2晶粒尺寸分别为19.6、23.3和25.8 nm,改性后的N-TiO2和S-TiO2晶粒尺寸有所增大。这是因为在煅烧过程N、S掺杂进入TiO2的晶格,产生了晶格膨胀进而导致晶粒尺寸增大[23]。

图1 TiO2、N-TiO2和S-TiO2的X射线衍射图谱Fig.1 X-ray diffraction(XRD)patterns of TiO2,N-TiO2and S-TiO2

2.2 傅里叶红外光谱分析

图2为TiO2、N-TiO2和S-TiO2的傅里叶红外图谱。三种样品在1000 cm-1以下出现的吸收峰为TiO2晶体中Ti-O的特征振动峰,在1630与3450 cm-1处分别出现归属于水分子中-OH的弯曲振动峰以及与钛原子相连的-OH的伸缩振动峰。N-TiO2样品中在1401 cm-1处出现N-H的弯曲振动峰,这可能是由于样品中掺杂的N与表面吸附的水所造成[24]。S-TiO2在1053和1406 cm-1处分别出现O-S的伸缩振动峰和S=O的不对称伸缩振动峰[25];在1200 cm-1处出现的C-O的弯曲振动峰,这可能是样品制备中硫脲造成的。

图2 TiO2、N-TiO2和S-TiO2的傅里叶红外图谱Fig.2 FTIR spectra of TiO2,N-TiO2and S-TiO2

2.3 TiO2、N-TiO2和S-TiO2对大肠杆菌的抑制效果

图3 TiO2、N-TiO2和S-TiO2对大肠杆菌的抑制效果Fig.3 Inhibition effect of TiO2,N-TiO2and S-TiO2 on E.coli

图4 TiO2、N-TiO2和S-TiO2对大肠杆菌抑菌率的影响Fig.4 Effect of TiO2,N-TiO2 and S-TiO2 on the antibacterial rate of E.coli

2.4 N、S改性TiO2材料光照处理后的大肠杆菌形态观察

对不同材料光照处理100 min后的大肠杆菌表面微观结构进行观察。空白组的大肠杆菌呈完整的杆状,表面光滑(图5a)。TiO2光照处理后的大肠杆菌表面粗糙,菌体皱缩,这是纳米TiO2颗粒附着在大肠杆菌表面所造成的(图5b)。经N-TiO2和S-TiO2光照处理后的大肠杆菌无完整形态,破损的菌体表面布满纳米材料颗粒。这表明光催化反应可以破坏大肠杆菌的生理活动,导致其失活,同时也证明了改性后的材料具有比TiO2更好的抑菌性能。

图5 不同材料光照处理后大肠杆菌的形态Fig.5 Morphology of E.coli after irradiation with different materials注a:空白组;b:TiO2组;c:N-TiO2组;d:S-TiO2组。

2.5 N、S改性TiO2/淀粉复合膜对大肠杆菌的抑制效果

图6为光照5 h不同淀粉复合膜对大肠杆菌的抑制效果,可以观察到这三种复合膜都没有形成明显的抑菌圈,这可能与复合材料无法在培养基上扩散有关。但是从图7可看出TiO2、N-TiO2和S-TiO2/淀粉复合膜上的大肠杆菌菌落数随光照时间的延长而迅速减少,当光照时间达到2 h后,三种复合膜上的菌落数逐渐接近于0。在光照时间2 h内,N-TiO2和S-TiO2/淀粉复合膜上菌落数少于TiO2/淀粉复合膜,这表明使用非金属元素N和S改性后的N-TiO2和S-TiO2/淀粉复合膜的抑菌能力强于TiO2/淀粉复合膜。

图6 TiO2、N-TiO2和S-TiO2/淀粉复合膜对大肠杆菌的抑制效果Fig.6 Antibacterial effect of TiO2,N-TiO2 and S-TiO2/starch composite films on E.coli

图7 TiO2、N-TiO2和S-TiO2/淀粉复合膜对大肠杆菌的抑制效果Fig.7 Antibacterial effect of TiO2,N-TiO2 and S-TiO2/starch composite films on E.coli

2.6 改性TiO2/淀粉复合涂膜对圣女果保鲜效果的影响

2.6.1 改性TiO2/淀粉复合涂膜对圣女果腐烂率的影响 采后果蔬在贮藏过程中会由于呼吸作用和蒸发作用引起自身水分损失,使得果实组织细胞失去原有的饱满状态,呈现萎蔫、疲软的形态,进而更容易遭受微生物的侵染而逐渐腐烂。由图7可看出,空白的淀粉膜具有抑制圣女果腐烂的作用,因为淀粉膜可以隔绝环境中微生物对圣女果的侵染。在光照下TiO2具有抑菌作用,因此添加TiO2粉体可以改善复合膜的抑菌性能。此外,添加一定量的TiO2粉体可以改善复合膜的物理性能,降低膜的透湿性和透气性,阻挡外部环境中微生物对圣女果的侵染作用[30]。经过改性后的N-TiO2和S-TiO2抑菌性能进一步增强,因此可以将圣女果的腐烂率抑制在较低的水平。其中S-TiO2/淀粉复合膜对圣女果的腐烂率抑制效果最好,相比无膜组,S-TiO2/淀粉复合膜对圣女果的腐烂率降低了6.25%。这可能是因为S-TiO2提高了光能利用率,产生了更多的超氧自由基和羟基自由基用以抑制微生物的活性[13,26]。

图8 不同复合淀粉膜对圣女果腐烂率的影响Fig.8 Effect of different composite starch films on the decay rates of cherry tomato

2.6.2 改性TiO2/淀粉复合涂膜对圣女果失重率的影响 新鲜果蔬都含有大量的水分和营养物质,随着果蔬成熟度的增加,果蔬内部的水分和营养物质会逐渐消耗,进而导致其质量减少[31]。从图7中可以看出,随着贮藏天数的增加,圣女果的失重率逐渐上升。其中,在贮藏的5 d后,相比于涂膜处理组,无膜组圣女果的失重率的快速上升。这说明涂膜处理能够抑制圣女果的水分和营养物质散失,使失重率较无涂膜处理的低。在复合涂膜中添加TiO2及改性后的N-TiO2和S-TiO2,圣女果的失重率进一步得到改善。这是因为添加适量的改性TiO2材料有助于淀粉分子间羟基的缔合并形成网状结构,从而减少了淀粉膜中的亲水基团,进而增强了复合膜的阻水性能[31],使涂膜圣女果的水分散失减少,从而抑制了失重率的升高。

图9 不同复合淀粉膜对圣女果失重率的影响Fig.9 Effect of different composite starch films on weight loss rates of cherry tomato

2.6.3 改性TiO2/淀粉复合涂膜对圣女果维生素C含量的影响 新鲜水果中富含维生素C(VC),作为一种高效的抗氧化剂,VC是衡量水果营养价值的重要指标。但是VC在贮藏过程中极易发生降解,所以常用VC含量损失率来评价水果的品质。图10是储存过程中VC含量的变化情况,经过8 d的贮藏,无膜组的VC含量为5.03 mg/100 g,而涂膜组的VC含量均高于5.34 mg/100 g。这说明涂膜处理可以延缓贮藏期间圣女果VC含量的损失。与空白淀粉膜相比,添加N-TiO2、S-TiO2涂膜的圣女果VC含量在贮藏后期依然较高。其原因是添加适量的复合材料降低了淀粉膜的透气性,抑制了淀粉膜内外的气体交换,造成淀粉膜内O2含量减少,CO2含量升高,减缓了VC的氧化[13];另一方面,涂膜处理造成淀粉膜内低O2分压减弱了圣女果的呼吸作用[33],使其所消耗的VC减少。但是,相对于只添加了TiO2的复合膜,N-TiO2/淀粉复合膜对VC含量降低的抑制作用并不明显。其原因可能是改性N-TiO2粒径有所增大,从而影响了淀粉膜的阻气性能。

图10 不同淀粉复合膜对圣女果VC含量的影响Fig.10 Effect of different composite starch films on VC contents of cherry tomato

2.6.4 改性TiO2/淀粉复合涂膜对圣女果总酸含量的影响 在圣女果贮藏过程中,其内部有机酸会逐渐转化成可溶性糖,所以其总酸含量会不断降低。图10是不同淀粉复合膜对圣女果总酸含量的影响。无膜组在贮藏8 d后总酸含量为5.02%,涂膜处理后的圣女果总酸含量均高于5.30%,说明涂膜处理可以抑制贮藏期内圣女果总酸含量的降低。其中经S-TiO2淀粉涂膜的圣女果在8 d后总酸含量达到5.62%。改性后的N-TiO2/淀粉复合膜对圣女果总酸含量的降低的抑制作用反而不如TiO2/淀粉复合膜。这可能是改性N-TiO2粒径有所增大[29],掺杂进淀粉膜后增大了淀粉网格的间隙,从而影响了淀粉膜的阻气性能,进而造成储存过程中圣女果的呼吸作用提升。

图11 不同淀粉复合膜对圣女果总酸含量的影响Fig.11 Effect of different starch composite films on total acid content of cherry tomato

2.6.5 改性TiO2/淀粉复合涂膜对圣女果总糖含量的影响 糖分含量是影响水果营养价值和口感的重要因素,是水果甜味的主要来源。在贮藏过程中,圣女果的呼吸作用会消耗糖分,所以总糖含量逐渐减少。从图11可以看出,涂膜处理可以抑制圣女果中总糖含量的降低。这是由于涂膜处理使淀粉膜内的O2分压降低,从而可以抑制了圣女果的呼吸作用。但是,相较于TiO2复合涂膜,S-TiO2/淀粉涂膜和N-TiO2/淀粉涂膜对总糖含量降低的抑制作用有限,这可能是因为S-TiO2/淀粉涂膜和N-TiO2/淀粉涂膜可以有效抑制圣女果的失重率,使贮藏期内的圣女果的水分含量的降低速度低于总糖含量的降低速度,最终造成TiO2复合涂膜的圣女果总糖含量比N-TiO2和S-TiO2/淀粉涂膜的偏高。

图12 不同淀粉复合膜对圣女果总糖含量的影响Fig.12 Effect of different starch composites films on the total sugar contents of cherry tomato

3 结论

以N、S元素对TiO2进行改性,XRD与FTIR分析表明:N、S元素掺杂进入TiO2中,使其局部发生微小畸变,但并未改变TiO2的晶型。改性后的N-TiO2、S-TiO2材料的光催化性能提高,因此光照下对大肠杆菌具有更好的抑制效果。与TiO2相比,N-TiO2、S-TiO2对大肠杆菌的抑制率分别提高了24%和30%。将改性后的S-TiO2、N-TiO2应用于淀粉涂膜液涂膜包装圣女果,结果表明:在贮藏8 d后,与无膜组相比,N-TiO2与S-TiO2/淀粉复合涂膜处理对圣女果的腐烂率和失重率均有较好的抑制效果,N-TiO2与S-TiO2/淀粉复合涂膜液均可有效降低圣女果VC含量、总酸含量和总糖含量的损失,维持圣女果的采后新鲜度。其中,S-TiO2/淀粉复合膜对圣女果的腐烂率、失重率以及营养物质损失的抑制作用效果更佳。