牛春艳，杨佳怡，王 晶，李 晶，刘文军

（1.中国计量科学研究院，北京 100029；2.中国科学院微生物研究所，北京 100101）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又称猪蓝耳病，是近年来造成养猪产业严重经济损失的高度传染性疾病[1]，最初在1980年左右于北美及欧洲被报道[2]。该疾病的病原体猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）为单股正链RNA病毒，隶属套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属。根据血清学和遗传特性的差异，PRRSV可分为2个型，即欧洲型（LV株为代表株）和美洲型（VR2332株为代表株）[3-4]。我国分离得到的毒株多为美洲型。2006年，我国多地区出现高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV）[5-6]，给养猪业造成巨大经济损失。基因组测序结果显示，相比于典型猪繁殖与呼吸综合征病毒，HP-PRRSV（变异株）在病毒GP5及Nsp2蛋白区域存在氨基酸突变及缺失[7]。

PRRSV的检测方法最初为病毒培养法，但是此方法耗时长且诊断敏感性低[8]。近年来发展的巢式PCR、实时荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）[9-10]、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术等方法极大缩短了检测时间，提高了检测敏感性。但是，qPCR对样本的定量分析依赖于标准曲线。数字PCR方法是最近发展起来的不依赖于外标对核酸分子进行定量的技术。由于数字PCR具有更高的灵敏度和准确性，已在微量核酸样本检测、稀有突变检测等方面有广阔应用前景，并受到越来越多的关注。对于RNA分子的定量检测，通常需要在逆转录酶的作用下，将RNA分子逆转录得到cDNA，从而进行扩增定量。因此，逆转录过程是RNA分子定量检测的关键步骤。本研究利用建立的逆转录数字PCR定量检测方法，分析了不同逆转录试剂盒产品对PRRSV定量结果的影响。

1 材料和方法

1.1 病毒和试剂 HP-PRRSV毒株HuN4及PRRSV毒株CH-1a为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。病毒RNA提取试剂盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit）及QuantiTect Reverse Transcription Kit购自QIAGEN公司；ProtoScript Ⅱ cDNA 第一链合成试剂盒购自NEB公司；Reverse Transcription System购自Promega公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser购自Takara公司； SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System 购自Invitrogen公司；TaqManTMGene Expression Master Mix购自Applied Biosystem（AB）公司；微滴式数字PCR反应液SuperMix for Probes、微滴发生专用油、微滴分析专用油购自Bio-Rad公司。

1.2 引物设计 将GenBank数据库中PRRSV基因序列进行比对，选择序列相对保守区域ORF6，设计引物及探针。F1：5'-CTAGGCCGCAAGTACATTCT-3'；R1：5'- GACGACAAATGCGTGGTTATC-3'；P1：5'- FAM-ATTTGCCGCAATCGGATGAAAGC C-BHQ1-3'。所有引物及探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 RNA提取及逆转录 按照QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN）试剂盒使用说明书，进行病毒基因组RNA提取。RNA保存于-80℃。按逆转录试剂盒说明书，将6 μL所提取的RNA在20 μL的反应体系中反转录形成cDNA。cDNA保存于-20℃。

1.4 荧光定量PCR实验 以逆转录得到的cDNA为模板进行荧光定量PCR实验。实验反应体系：TaqManTMGene Expression Master Mix（AB）12.5 μL，上、下游引物各1 μL（终浓度200 nmol/L），探针1 μL（终浓度400 nmol/L），cDNA模板2 μL，加ddH2O补足终体积至25 μL。扩增条件为：95℃预变性10 min；95℃ 变性30 s，60℃退火1 min，40个循环；98℃变性10 min。用包含PRRSV ORF6及ORF7基因序列的线性化质粒（中国计量科学研究院制备并定值）绘制标准曲线，对不同浓度的PRRSV cDNA进行定量检测。

1.5 数字PCR实验 以逆转录得到的cDNA为模板进行数字PCR实验。反应体系为：SuperMix for Probes（Bio-rad）10 μL，上、下游引物各0.8 μL（终浓度400 nmol/L），探针0.8 μL（终浓度240 nmol/L），cDNA模板4 μL，加ddH2O补足终体积至20 μL。将20 μL反应混合液分装至对应微滴生成卡的sample孔位中，在微滴生成卡的Oil孔位中加入70 μL 微滴发生专用油，进行微滴生成。将生成的微滴（40 μL）转入96孔深孔板中进行PCR反应。扩增条件为：95℃预变性10 min；95℃ 变性30 s，54℃退火1 min，40个循环；98℃ 变性10 min。数字PCR反应扩增结束后，利用Droplet Reader进行结果的读取。选择反应中产生的可接受的平均微滴数目大于10 000的结果用于分析，保证定量分析的准确性。

1.6 数字PCR反应线性关系及重复性研究 将逆转录得到的cDNA进行梯度稀释，每个浓度梯度设置6次重复，进行数字PCR反应的线性关系研究。以6次重复实验的结果计算变异系数（CV），研究数字PCR反应重复性。

1.7 逆转录反应重复性及再现性研究 利用NEB公司逆转录试剂盒对RNA进行逆转录，设置3次独立重复逆转录实验，将得到的cDNA稀释后作为模板，进行数字PCR扩增，并在不同时间内分别进行独立重复逆转录实验，研究逆转录反应重复性及再现性。

1.8 不同逆转录试剂盒的扩增结果比较 使用5种逆转录试剂盒将RNA模板逆转录，设置3次独立重复逆转录实验。将得到的cDNA稀释后作为模板，进行数字PCR定量分析。比较不同逆转录试剂盒对定量结果的影响。

2 结果

2.1 数字PCR方法的参数优化 采用荧光定量PCR对引物及探针的浓度进行优化，设置引物浓度为100、200、300、400、800 nmol/L，设置探针浓度为120、240、400 nmol/L。综合考虑Cq值及荧光扩增信号，并选择在数字PCR反应中能将阴性扩增信号与阳性扩增信号明显分开的条件作为最优条件。最终选择的体系为：引物浓度400 nmol/L，探针浓度240 nmol/L。设置退火温度梯度为50℃～60℃。根据阴性扩增信号与阳性扩增信号差异最大的原则，选择54℃作为退火条件（图1）。

2.2 数字PCR方法的线性关系及重复性 在利用数字PCR方法检测核酸浓度时，需要将核酸浓度稀释到数字PCR的检测范围内进行检测。将cDNA梯度稀释后进行数字PCR扩增反应，结果表明，实验所建立的数字PCR方法至少在5个数量级范围内线性关系良好，HuN4及CH-1a对应的R2分别为0.9995及0.9999（图2）。以6次重复实验的结果计算变异系数，结果如表1所示，实验所建立的数字PCR方法在4个数量级范围内变异系数小于10%（1.01%～9.61%，最小变异系数为1.01%），实验在此范围内重复性良好。

图1 数字PCR反应退火温度优化Fig.1 Optimization of annealing temperature for ddPCR

2.3 逆转录反应的重复性及再现性 由于实验拟考察不同逆转录产品对于数字PCR定值结果的影响，因此必须首先保证实验方法的可重复性与可再现性。从结果2.2可以看到，对于同一逆转录产物（cDNA）进行数字PCR定量分析，最小变异系数为1.01%，证明基于数字PCR定量方法的重复性较好。通过设置不同逆转录独立重复实验，并在不同时间内分别进行反应，计算实验结果变异系数，反映逆转录反应重复性及再现性。如表2及图3所示，三次平行反应间的变异系数为0.69%～3.00%，三次不同时间独立重复实验间的变异系数分别为2.38%及2.47%。

2.4 数字PCR与荧光定量PCR检测结果的比较 利用10倍梯度稀释的线性化质粒绘制标准曲线，标曲斜率为-3.3927，对应扩增效率为97%，R2为0.9993。将10倍梯度稀释的HuN4与Ch-1a两种病毒cDNA分子分别利用数字PCR与荧光定量PCR进行定量检测，并将二者的检测结果进行相关性分析，如图4所示，发现数字PCR与荧光定量PCR方法之间存在良好的线性相关性（R2分别为0.998及0.994）。

图2 数字PCR线性关系Fig.2 Linearity of ddPCR

表1 数字PCR方法的重复性Table 1 Repeatability of ddPCR

2.5 不同逆转录试剂盒对PRRSV定量检测结果的影响 利用5种不同逆转录试剂盒，对HuN4及CH-1a两种病毒RNA进行逆转录后，用逆转录数字PCR方法进行定量检测。从图4可以看到，对于同一种RNA，利用5种不同逆转录试剂盒，最后的定量结果有所不同。利用试剂盒A进行逆转录，HuN4及CH-1a两种样品的定量结果均为最低；利用试剂盒B、C、D、E进行逆转录，将HuN4及CH-1a两种样品得到的定量结果分别进行统计学分析，均发现p＜0.01，因此利用这4个试剂盒进行逆转录，得到的结果存在显著性，具有统计学意义。本研究采用5种不同逆转录试剂盒对同种病毒RNA进行逆转录后，采用同种逆转录数字PCR方法进行定量检测，且逆转录数字PCR方法的线性、重复性及再现性均经过确认和验证，由此可见不同逆转录试剂盒获得的不同结果是由逆转录试剂盒本身所造成的。

表2 逆转录反应的重复性及再现性Table 2 Repeatability and reproducibility of reverse transcription process

图3 逆转录反应的重复性及再现性Fig.3 Repeatability and reproducibility of reverse transcription process

3 讨论

数字PCR的原理是将一个PCR反应体系分配到大量微小的反应单元中，在每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子，进行“单分子模板”PCR扩增[11]。扩增结束后，通过阳性反应单元（通过终点荧光信号判断）的数目和统计学方法计算原始样本中目标基因的拷贝数。因此，数字PCR可以实现核酸分子的绝对定量。对于RNA定量，首先需要将RNA进行逆转录得到cDNA，才能进行扩增定量。如果逆转录过程中没有将RNA分子全部转换为cDNA，则无法被准确定量。因此逆转录的过程直接影响最后的定量结果。逆转录酶已有商品化试剂，或是整合了逆转录酶及反应所需的缓冲液、核苷酸、引物等，形成的逆转录试剂盒。实验室在通常情况下，都是选择一种逆转录酶产品进行方法研究。本文通过建立的PRRSV逆转录数字PCR定量检测方法，探讨了不同逆转录试剂盒产品对定量结果的影响。

图4 PRRSV数字PCR及荧光定量PCR检测Fig. 4 Quantification of PRRSV by ddPCR and qPCR

图5 不同逆转录试剂盒对PRRSV定量检测结果的影响Fig.5 The effect of different reverse transcription kits on the quantitative results of PRRSV

针对PRRSV RNA分子的检测，本实验建立了逆转录数字PCR定量方法。首先利用逆转录试剂盒产品将RNA分子逆转录，将得到的cDNA作为模板进行数字PCR扩增。可以看到，对于同一种逆转录酶得到的cDNA模板，建立的数字PCR方法线性及重复性良好，并且与建立的荧光定量PCR方法的检测结果具有良好的线性相关性，因此可用于比较逆转录酶产品对定量结果的影响[9]。本研究共选择了5种不同逆转录试剂盒进行比较，其中利用试剂盒A进行逆转录，对HuN4及CH-1a两种菌株的RNA分子定量结果均明显低于其他试剂盒[6]。利用其他4种试剂盒进行逆转录，得到的定量结果通过统计分析组内差异与组间差异，发现存在统计学差异。而且，对于HuN4及CH-1a两种模板，不同试剂盒定量结果差异的程度有所不同。分析数字PCR定量结果存在差异原因，可能有两个方面：一方面，可能由于不同厂家所生产的逆转录酶活力、纯度等有所不同，造成目标RNA转录为cDNA的数量有所不同，未被逆转录的目标RNA则不会被扩增；另一方面，可能由于不同厂家试剂盒生产试剂盒中加入的试剂不同，对后续PCR反应有不同程度的抑制作用存在，造成逆转录得到的cDNA不能被完全扩增定量，从而影响了后续基于数字PCR的定量检测结果。

因此，在对RNA分子进行定量检测时，无论扩增反应优化的程度如何，逆转录的过程都将直接影响定量结果。在涉及逆转录过程的定量检测方法建立的过程中，应对逆转录产品进行考察和选择。