吴海波1,2,任桂凤1,刘松勇1,黄 莹1,覃秀荧1,江连洲

(1.北部湾大学食品工程学院,广西钦州 535011;2.钦州市特色果蔬发酵重点实验室,广西钦州 535011;3.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

大豆起源于中国,是重要的粮食作物、油料作物,为世界五大油料作物之一。在我国,大豆油产量和消费量长期以来一直居于食用植物油首位[1]。目前工业上常用有机溶剂浸提法制取大豆油,尽管出油率高,成本低,但浸提后溶剂易残留油中,且粕中蛋白变性严重[2]。特别是溶剂浸提以及后期脱胶、脱酸、脱色等精炼阶段。油脂长时间处于高温环境易导致油脂氧化劣变[3]和一些有益物质的损失[4],进而影响油的品质。

水相酶法提油是近些年兴起的一项有希望取代溶剂浸提制油的环境友好技术,它利用水作为提取介质的同时添加具有破坏植物细胞壁或油脂体结构的酶,促进油脂释放,同时蛋白及一些亲水性物质溶解到水相中,从而达到油和蛋白同时提取的目的,具有无溶剂残留,蛋白变性程度轻的优点[5]。目前已在大豆[6]、玉米[7]、葵花籽[8]、花生[9]、菜籽[2]等粮油作物中展开广泛研究,并取得良好效果。但是水酶法提取大豆油工艺直接得到的游离油非常有限,大部分油都存在于提油过程形成的乳状液中,需经适当的破乳方式才能回收其中的油。因此破乳是水酶法提油工艺的关键技术,目前破乳效果较好的方法主要有等电点法[10]、加热破乳[11]、添加无机盐[12]、酶法破乳[13]等。水酶法提取的油大部分来自于破乳回收,破乳油的品质直接影响水酶法提取油的食用品质,但对于这些破乳方式回收油的品质以及脂肪酸组成目前却鲜有报道。

本实验在前期获得较高总油提取率制备条件基础上[14],针对粗酶提油过程产生的乳状液分别采用加热、等电点法、添加CaCl2法、Alcalase酶法破乳,分析各破乳方式回收油的理化性质和脂肪酸组成,并对粗酶水相提油工艺同步所得蛋白的氨基酸组成及风味进行鉴定,旨在综合评估粗酶提取工艺所得大豆油和蛋白品质,为环境友好绿色制油技术的发展提供科学技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆(垦农22号) 黑龙江省农科院,贮存于4 ℃冰箱中;Alcalase碱性蛋白酶(1.2×105U/mL) 诺维信(中国)生物技术有限公司;棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯 标准品,美国Sigma公司;氢氧化钠、盐酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、氯化钙、一水合硫酸氢钠、氢氧化钾 国药集团;奎宁 上海源叶生物科技有限公司;甲醇 天津市天力化学试剂有限公司;正已烷 广东火华科技股份有限公司;枯草芽孢杆菌ATCC 20524 中国工业微生物菌种保藏中心;发酵培养基:0.57%低温脱脂豆粕,1.48%葡萄糖,0.05%KH2PO4,0.5%吐温80,pH9,121 ℃灭菌20 min。

7890-A气相色谱 美国安捷伦公司;A200氨基酸分析仪 德国安米诺西斯公司;TU-1901型双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;MY型双螺杆挤压机 江苏牧羊集团;FW80型锤片式粉碎机 中国天津泰斯特仪器有限公司;FD-1型冷冻干燥机 北京比朗实验设备有限公司;XMTD-7000电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 挤压膨化豆粉的制备 将大豆粉碎过3 mm筛板后,调节水分含量至14%,在挤压膨化机套筒温度90 ℃,螺杆转速100 r/min,模孔孔径18 mm条件下挤压膨化[15],所得膨化物料粉碎并过100目筛,此时膨化豆粉中油含量22.1%,蛋白质含量32.8%,贮存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 粗酶液的制备 采用吴海波等[14]的方法制备粗酶液,主要步骤为:将活化后的枯草芽孢杆菌接入发酵培养基中35 ℃培养42 h,5000 r/min离心20 min,所得上清液采用硫酸铵盐析沉淀,4 ℃过夜,离心所得沉淀物装入透析袋中,置于Tris-HCl缓冲液中透析,得到去盐且同时含有碱性蛋白酶和中性蛋白酶的粗酶液。

1.2.3 粗酶水相制取大豆油和蛋白 参照吴海波等[6]的方法,在粗酶液中加入磷酸一氢钠和磷酸二氢钠配制成缓冲酶液,在粗酶液碱性蛋白酶活(2000±200) U/mL,中性蛋白酶活(1500±200) U/mL时,加入膨化豆粉,使膨化豆粉:酶液比为1∶8 g/mL,在55 ℃,起始pH10时酶解6 h,90 ℃加热10 min灭酶,4 500 r/min离心20 min,得到豆渣、水解液、乳状液、游离油四层物质,分别将水解液、乳状液、游离油从离心管中分离出来,备用。水解液用 2 mol/L的HCl调节至pH4左右,3000 r/min离心15 min得到沉淀的蛋白,将蛋白水洗2次后调至pH7,冷冻干燥制成粗酶水解大豆蛋白冻干粉。

1.2.4 不同方式破乳 分别采用加热、添加CaCl2、Alcalase碱性蛋白酶(Alcalase酶)酶解、调节等电点方式破乳回收乳状液中的油,具体工艺如下:

加热法破乳:取1.2.2中获得的乳状液放入烧杯置于90 ℃水浴中加热反应20 min,3000 r/min离心20 min后回收乳状液中的游离油。

添加CaCl2法破乳:向1.2.2乳状液中添加CaCl2,使CaCl2浓度为0.08 mol/L,70 ℃条件下加热搅拌(300 r/min)30 min,3000 r/min离心20 min后回收乳状液中的游离油[12]。

Alcalase酶解破乳:将装有乳状液的烧杯置于55 ℃的水浴锅中,添加2%(w/w)Alcalase碱性蛋白酶,pH9条件下酶解30 min,3000 r/min离心20 min后回收乳状液中的游离油[13]。

等电点方式破乳:将加热至50 ℃的乳状液用2 mol/L的盐酸调节至pH4并保持30 min,3000 r/min离心20 min后回收乳状液中的游离油[12]。

1.2.5 有机溶剂浸提制油 参考吴海波等[14]的方法将大豆粉碎并过100目筛,豆粉与正已烷按料液比1∶6 g/mL混合,55 ℃条件下连续浸提6 h后,将油与溶剂混合物置于旋转蒸发仪中真空浓缩至无溶剂蒸出,再用氮气吹干油中残余溶剂,所得油收集保存待用。

表1 不同破乳方式所得大豆油的色泽Table 1 Color of soy oil obtained by different demulsification methods

1.2.6 Alcalase酶水解豆粉提取蛋白 参考吴海波等[14]的方法,采用Alcalase碱性蛋白酶,将1.2.1中所得大豆粉在料水比1∶6.5 g/mL,加酶量2%(w/w),酶解温度57 ℃,pH9.5时酶解3 h,再按1.2.2的方法处理水解液制备Alcalase酶解大豆蛋白冻干粉。

1.2.7 回收油的理化性质分析 将溶剂浸提油以及各破乳方式回收油分别进行色泽、酸值、过氧化值、碘值、皂化值的检测。油脂色泽检验参照GB/T 22460-2008;油脂酸价检验参照GB 5009.229-2016;油脂过氧化值检验参照GB 5009.227-2016;油脂碘值检验参照GB/T 5532-2008;油脂皂化值检验参照GB/T 5534-2008。

1.2.8 油的脂肪酸组成分析 采用气相色谱检测溶剂浸提油和各破乳方式回收油的脂肪酸组成。

油的甲酯化:借鉴朱云等[16]的方法,称取50 mg大豆油样品置于容量瓶中,加入4 mL异辛烷,加入1 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液0.5 mL,摇匀,再加入1 g一水合硫酸氢钠,振摇30 s,静置5 min,取上清液待测。

气相色谱分析条件:气相色谱柱CP-88(100 m×0.25 mm×0.2 μm),进样量1.0 μL,载气为氮气,流速为1 mL/min,分流比为20∶1;进样口温度为250 ℃,检测器温度300 ℃;氢气流量30 mL/min;空气流量400 mL/min;升温程序为初始温度90 ℃,保持2 min后以20 ℃/min的速度升温至170 ℃,保持18 min,以4 ℃/min的速度升温至230 ℃,保持24 min,最后以30 ℃/min的速度升温至250 ℃,保持10 min。采用外标法对每个油样进行测定。

1.2.9 水解蛋白苦味值的评定 以奎宁溶液作为标准溶液对粗酶水解蛋白溶液进行苦味评估[17]。以0、8、16、24、32、40 mg/L浓度的奎宁溶液分别对应0、1、2、3、4、5苦味分值,分值越高,苦味越强。评定小组由经过感官培训的10人组成。评定员用蒸馏水漱口之后,取浓度10 mg/mL经粗酶或Alcalase碱性蛋白酶提取的蛋白溶液适量置于口中片刻后吐出,并与标准液对比,进行评分[18]。

1.2.10 水解蛋白的氨基酸组成测定 将1.2.1中挤压膨化前的大豆粉、1.2.2中粗酶水解大豆蛋白冻干粉和1.2.5中Alcalase酶解大豆蛋白冻干粉,分别溶于6 mol/L HCl中,110 ℃水解24 h,过滤并真空干燥,溶解后定容至100 mL。以50 μL为上样量,采用自动氨基酸分析仪检测,所测结果以占蛋白质质量分数表示[19]。

1.3 数据处理

所有实验均进行3次,采用Statistix 8.1软件对实验数据进行统计分析,比较数值间差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 各破乳方式回收油的理化特性

2.1.1 回收油的色泽比较 表1显示溶剂浸提制取的油红色数值高于所有破乳回收油,即溶剂浸提油颜色更深,而各破乳方式回收油的色泽一致。溶剂浸提时会将大豆中原有的脂溶性色素物质部分溶出,导致油的色泽变深;较高的浸提温度也会使大豆原料中蛋白质与糖类发生美拉德反应产生色素物质,在溶剂浸提时溶解于油中[20]。相关研究表明溶剂浸提以及后期溶剂回收阶段长时高温处理会使油脂发生氧化、聚合等反应,产生共轭二烯类发光物质,导致油的颜色进一步加深[21]。

2.1.2 回收油的酸价 酸价标志着油脂的新鲜程度,油脂酸价高说明油中发生氧化或水解反应产生的游离脂肪酸含量高,油的品质不新鲜,因此酸价是反映油脂品质优劣的重要指标[22]。图1显示各破乳方式所得油的酸价均显著低于溶剂浸提油(P<0.05),四种破乳方式中等电点法破乳回收油的酸价最高,达0.83 mg/g,其次为加热破乳油,Alcalase酶和CaCl2破乳所得油酸价最低,仅为0.52 mg/g。由于在溶剂浸提和溶剂回收阶段,油脂长时间受热导致甘油三酯发生氧化、氧化裂解及氧化聚合等劣变反应,产生较多的氧化和分解产物,如游离脂肪酸[23-24],因此溶剂浸提油酸价最高。粗酶水解豆粉提油阶段由于提取介质为水,水可以溶解部分游离脂肪酸,导致乳状液中游离脂肪酸含量低[25]。等电点法破乳时由于HCl的加入,使破乳油体系中H+含量增加,这可能造成采用氢氧化钾滴定法测定的油脂酸价升高。Alcalase碱性蛋白酶和CaCl2破乳过程中,加热温度较低,油脂受热时间短,因此酸价最低。加热破乳(90 ℃受热20 min)由于破乳温度高于Alcalase碱性蛋白酶法和CaCl2法,因此氧化反应加强,破乳油酸价较二者高。Liu等[26]和Hu等[4]分别采用水酶法提取无患子和樱桃籽油,结果显示水酶法提取油的游离脂肪酸含量均低于浸提法,与本文研究结论一致。

图1 不同破乳方式所得大豆油的酸价Fig.1 Acid value of soybean oil obtained by different demulsification methods注:不同字母表示数值间差异显著(P<0.05),图2～图4同。

图2 不同破乳方式所得大豆油的过氧化值Fig.2 Peroxide value of soybean oil obtained by different demulsification methods

2.1.3 油的过氧化值 过氧化值测定的是油脂中氧化物质含量,代表油脂的氧化程度[22],实验结果见图2。溶剂浸提制取的油过氧化值最高,达1.10 μg/g,其次是加热破乳回收的油,为0.85 μg/g,等电点法次之,Alcalase酶和CaCl2破乳油过氧化值最低(见图2),仅为0.62 μg/g。脂类氧化程度受多种因素影响,温度越高,油脂氧化速率越快,生成的过氧化物越多,油脂劣变加重[27];油脂中含氧量越高,氧化速率越快,过氧化值越高[28]。有机溶剂提取大豆油过程中,不仅受热温度高,而且时间长,增加了油与氧的接触时间,因此制取的油过氧化值最高。水酶法提油过程中油滴存在于O/W体系中,氧必须扩散至水相并通过水-油界面才能接近油滴,因此氧化速率较慢,而且酶水解豆粉过程产生的水解蛋白具有一定的抗氧化活性,一定程度抑制了油的氧化[14],因此乳状液中的油过氧化值较低。加热破乳温度较高,因此油的过氧化值高于其他破乳方法;等电点法破乳尽管在较低温度下进行,但由于酸的加入,增加了油脂体系中H+供体的含量,与油脂氧化过程中的过氧基自由基结合[29],生成了更多的氢过氧化物,导致油脂的过氧化值增加。Gai等[24]采用水酶法提取连翘籽油,结果显示水酶法提取油的过氧化值低于浸提法,与本研究结论一致。

2.1.4 油的皂化值 皂化值是测定油中游离脂肪酸和甘油酯含量的指标,即为酯值与酸值的总和,结果见图3,各破乳方法所得油皂化值均显著低于浸提油(P<0.05),其主要原因是由于浸提油较高的酸值导致。Latif等[30]分别采用Alcalase碱性蛋白酶、7L中性蛋白酶、Viscozyme复合酶等酶水相提取辣木籽油,发现各酶提取的油皂化值均低于溶剂浸提油,与本研究结论一致。

图3 不同破乳方式所得大豆油的皂化值Fig.3 Saponification value of soybean oil obtained by different demulsification methods

2.1.5 油的碘值 碘值与油脂中脂肪酸的不饱和程度和含量有关[21],碘值低意味着油中含有的不饱和双键脂肪酸含量少,油脂较稳定不易酸败。如图4,各破乳方式所得油的碘值均显著低于溶剂浸提油(P<0.05),但各破乳油间碘值无显著差异(P>0.05)。水酶法制油由于在水相中进行,乳状液中的不饱和游离脂肪酸会部分溶解于水中[24],从而导致破乳回收油的碘值较低。

图4 不同破乳方式所得大豆油的碘值Fig.4 Iodine value of soybean oil obtained by different demulsification methods

因此粗酶水相制取大豆油过程形成的乳状液经各方式破乳回收的油未经脱酸、脱色等工艺,其色度、酸值、过氧化值、皂化值、碘值均低于溶剂浸提油,达到国家成品大豆油二级质量标准(GB/T 1535-2017),说明粗酶水相提取以及上述破乳方式没有降低油的理化性质,较于溶剂浸提,更好地保持了油的品质。

表2 不同破乳方式所得大豆油的脂肪酸组成Table 2 Fat acid compositions of soy oil obtained by different demulsification methods(%)

2.2 不同破乳方式所得大豆油的脂肪酸组成

大豆油由多种脂肪酸构成,其中不饱和脂肪酸由亚麻酸、亚油酸和油酸组成,不饱和脂肪酸对于形成细胞结构、合成磷脂、调节血压、降低血清胆固醇、抗癌以及维持人体正常生理代谢具有重要的作用[31-33]。

表2表明破乳回收油与溶剂浸提油各脂肪酸含量存有差异,但脂肪酸组成基本相同,均以不饱和脂肪酸为主,溶剂浸出油、Alcalase酶破乳油、CaCl2破乳油、等电点破乳油、加热破乳油中总不饱和脂肪酸含量分别为84.42%、84.49%、84.61%、84.45%、84.47%,符合国际法典委员会推荐的食用油标准[34],说明粗酶水相提取的大豆油仍然保持原有营养价值。Hou等[3]和Hu等[4]采用水酶法分别提取山桐子油和樱桃籽油,结果显示水酶法提取油的脂肪酸组成与溶剂浸提油相似,这与本研究结论一致。

2.3 粗酶水解蛋白的氨基酸组成和风味

大豆蛋白质富含人体所需的8种必需氨基酸,是一种能满足人体生长所需的优质蛋白[35]。表3显示粗酶水解蛋白、Alcalase酶解蛋白与原料大豆蛋白氨基酸组成相同,均含有8种必需氨基酸,各必需氨基酸含量与原料豆相近,即粗酶水相提油工艺没有破坏大豆蛋白的营养价值,这与其他学者的研究结论一致[36-37]。

表3 酶解蛋白中氨基酸组成(%)Table 3 Amino acid composition of soybean protein hydrolysates(%)

通过对Alcalase酶和粗酶水解蛋白样品液的品尝,结果显示Alcalase酶解蛋白具有明显的苦味,为4分,而粗酶水解蛋白呈中度苦,为3分(见图5)。水解蛋白呈现苦味是由于在水解过程中形成的苦味肽导致[38],而苦味肽的苦味主要来自于其含有的疏水性氨基酸,未经水解的蛋白中大部分疏水性氨基酸侧链藏在分子内部,不接触味蕾,因此感受不到苦味,一旦蛋白水解,伴随水解进程,掩藏在分子内部的疏水性氨基酸侧链不断暴露出来,接触到味蕾,因此感受到苦味[39]。疏水性氨基酸残基的羧基端肽键是Alcalase蛋白酶的主要酶切位点,极易被Alcalase酶识别和水解,从蛋白内部暴露出来,因而Alcalase酶解蛋白苦味较重[40],而粗酶中不仅含碱性蛋白酶还含有部分中性蛋白酶[14],导致对疏水氨基酸残基的识别与水解能力下降,因此暴露出来的疏水氨基酸侧链减少,苦味减弱。另外,表3显示Alcalase酶解蛋白中疏水性氨基酸所占比例高于粗酶水解蛋白,这与它们的苦味强弱结果一致。

图5 蛋白的苦味值Fig.5 Bitter value of soybean protein

3 结论

实验结果显示等电点法、加热、添加CaCl2、Alcalase酶法破乳油的品质均优于溶剂浸提油,各破乳油的色泽、酸价、过氧化值、皂化值、碘值均低于溶剂浸提油。其中CaCl2和Alcalase酶法破乳油的品质最新鲜,酸值和过氧化值最低,分别为0.52 mg/g、0.62 μg/g,等电点和加热破乳油受酸和高温的影响导致酸价和过氧化值高于其他破乳油,分别为0.83 mg/g、0.85 μg/g。各破乳油在色泽、皂化值和碘值方面无显著性差异(P>0.05)。破乳油脂肪酸组成与溶剂浸提油相同,尽管含量与溶剂浸提油存有差异,但仍以不饱和脂肪酸为主。粗酶提油工艺所得水解蛋白必需氨基酸含量与原料豆相近,苦味值3分,苦味程度低于Alcalase酶解蛋白。本研究显示破乳油比溶剂浸提油具有更好的品质,粗酶水解蛋白仍保持大豆蛋白原有的营养价值,这为水酶法制取大豆油技术的发展和应用提供了一定的科学理论依据。