李 冲,周 妍,李益东,赵 欣

(重庆第二师范学院生物与化学工程学院,重庆市功能性食品协同创新中心,重庆市功能性食品工程技术研究中心,功能性食品研发重庆市工程实验室,重庆 400067)

茶原产于中国南方的巴渝地区,作为药用饮料备受关注[1]。根据加工方法的不同,茶叶可分为非发酵茶(如绿茶)、半发酵茶(如乌龙茶)和全发酵茶(如红茶),生物活性成分也有很大的不同。茶多酚是茶叶中的主要有效成分,具有强烈的自由基清除和还原活性[2]。巫山神茶作为别样茶,不属于典型的山茶科山茶属来源的植物,其产自于长江三峡流域重庆市巫山段,主要由当地野生林檎(Malus mellina(Hana-Mazz)Rehd)嫩叶精制加工而成,其叶片含有多种对人体有益的氨基酸、维生素、黄酮类化合物以及微量元素[3-4]。因生长在无污染环境中,采摘后的生叶可直接在适宜温度、湿度下干燥,进行自身发酵及一系列复杂化学变化,形成巫山神茶独特的风味和口感。研究发现,巫山神茶叶片具有多种保健功能,包括减肥、降血压及血脂、舒缓神经、抗衰老、强化牙齿、抑制炎症、预防癌症以及提高免疫力等[5-6]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

巫山神茶(规格:100 g) 重庆市巫山县峡江茶业有限公司提供;293T人胚肾细胞 由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心购入;DPPH 东京化成工业株式会社;DEME细胞培养基(高糖)、胎牛血清、青-链霉素双抗、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO) 美国Sigma公司;丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)试剂盒 南京建成生物工程研究所;绿原酸、表儿茶素没食子酸酯、对香豆酸、异槲皮苷、二氢槲皮素、槲皮苷、黄芩苷、槲皮素及根皮素标准品 北京索莱宝科技有限公司;Trizol试剂、Oligo(dT)18、RNase、dNTP、MLV逆转录酶 美国Invitrogen公司;ROX reference dye、SYBR Premix Ex TaqⅡ 日本Takara公司;MTT、ABTS、无水乙醇、PBS(0.01 mol/L)、七水合硫酸亚铁、过氧化氢、FL-3大孔树脂、水杨酸、过硫酸钾 均为国产分析级。

BioMate 3S UV-Visible光度计、UltiMate3000 HPLC、QuantStudioTM6 Flex聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;EYELA N-1001S旋转蒸发仪 日本东京理化器械株式会社;MCO-15AC二氧化碳细胞培养箱 日本三洋公司;Centrifuge 5418R冷冻离心机 德国Eppendorf公司;ELx808酶标仪 美国Bio-Tek公司;FLUOstar OPTIMA荧光酶标仪 德国BMG公司;粉碎机、纯水机、水浴锅、烘箱、真空泵、水浴锅、万分之一电子天平 均为国产仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 巫山神茶提取物制备 将巫山神茶在60 ℃下烘干,粉碎、研磨后过筛(150目),然后精密称取一定量巫山神茶粉末于烧杯中,按液料比20∶1 g/mL加入70%乙醇,60 ℃水浴2 h,重复两次,抽滤,取液体备用,过FL-3大孔树脂(双蒸水洗至无色后,70%乙醇洗脱)。将过树脂的液体通过旋转蒸发仪(60 ℃)除去水和乙醇(蒸至烧杯无液体流动为止),于60 ℃恒温干燥48 h。将烘干样品取出,研磨、称重后封存于EP管中,放置于4 ℃环境中,备用[12]。

1.2.2 体外抗氧化实验

1.2.2.1 羟基自由基清除实验 水杨酸比色法[13]。取10 mL具塞试管,加入2 mL不同浓度(0.2、0.6、1.0 mg/mL)巫山神茶提取物,依次加入2 mL的9 mmol/L乙醇-水杨酸溶液,1 mL的9 mmol/L硫酸亚铁溶液(七水硫酸亚铁配制),最后加入2 mL的8.8 mmol/L过氧化氢启动反应。37 ℃水浴30 min,510 nm处测定OD值。每组三个平行。0.2 mg/mL的VC溶液作阳性对照,下同。清除率计算公式:

羟基自由基清除率(%)=[1-(Ab-Ac)/Ad]×100

式中:Ab:工作液加入巫山神茶后OD值;Ac:双蒸水代替H2O2作本底比色OD值;Ad:空白对照液OD值。

1.2.2.2 DPPH自由基清除实验 将0.5 mL不同浓度(0.2、0.6、1.0 mg/mL)的巫山神茶提取物添加到2 mL的DPPH乙醇溶液(0.33 mmol/L)中,混合后在室温下在黑暗中静置30 min。在517 nm处测定溶液的吸光度[14]。每组三个平行。清除率计算公式:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ae-Af)/Ag]×100

式中:Ae:DPPH工作液+巫山神茶样液OD值;Af:空白校正,巫山神茶样液+乙醇OD值;Ag:空白对照,DPPH工作液+乙醇OD值。

1.2.2.3 ABTS+·清除实验 ABTS自由基工作液配制:A液:将3 mg的ABTS加入0.8 mL双蒸水中,混合、溶解;B液:将1 mg的过硫酸钾加入1.5 mL双蒸水中,混合、溶解;各取A、B液0.2 mL混合后,黑暗放置氧化12 h,用无水乙醇稀释至A734的OD值在0.7±0.02范围[15]。

ABTS清除实验:取5 mL具塞试管,加入1 mL的ABTS自由基工作液,加入0.4 mL不同浓度(0.2、0.6、1.0 mg/mL)的巫山神茶提取物,补齐溶剂,黑暗放置30 min,于734 nm处测定OD值。每组三个平行。

清除率计算公式:

ABTS自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100

式中:Ai:ABTS工作液+巫山神茶样液OD值;Aj:空白校正,巫山神茶样液+无水乙醇OD值;Ao:空白对照,ABTS工作液+无水乙醇OD值。

1.2.2.4 超氧阴离子清除实验 邻苯三酚自氧化法[16]。取10 mL具塞试管,加入1 mL不同浓度(0.2、0.6、1.0 mg/mL)的巫山神茶提取物,然后依次加入4.5 mL的0.1 mol/L的Tris-HCL(pH=8.2)的缓冲液,于37 ℃水浴反应20 min,冷却至室温,再加入0.4 mL的50 mmol/L的邻苯三酚溶液,37 ℃水浴反应5 min,立刻加入0.1 mL的8.0 mol/L浓HCl终止反应,在320 nm处测其吸光度值。每组三个平行。0.1 mol/L的Tris-HCl(pH=8.2)缓冲液配制:50 mL的0.1 mol/L的Tris溶液溶于22.9 mL的0.1 mol/L的盐酸溶液,加去离子水定容至100 mL。清除率计算公式为:

超氧阴离子自由基清除率(%)=[1-(Am-An)/Ap]×100

式中:Am:超氧阴离子工作液+巫山神茶样液OD值;An:去离子水代替邻苯三酚作巫山神茶本底OD值;Ap:去离子水代替巫山神茶的OD值。

1.2.3 293T细胞培养 将从液氮中取出的293T细胞复苏后,接种于DEME培养基(高糖,含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗体溶液)中,在37 ℃和5%二氧化碳含量的饱和潮湿环境中培养,培养基每周更换2～3次。细胞融合度达90%时,胰蛋白酶(0.25%)消化传代。所有试验均采用对数期细胞。

1.2.4 巫山神茶对293T细胞毒性实验 将293T细胞悬液(1×104cells/mL)接种于96孔细胞培养板中(60 μL细胞+100 μL培养基),37 ℃培养24 h直至贴壁后,加入20 μL不同浓度(正常组、40、100、160 μg/mL)的巫山神茶水溶液培养24 h,采用MTT法测定细胞存活率。

MTT法测定细胞存活率:293T细胞首先按照前述进行24 h贴壁培养后,加入20 μL不同浓度(正常组、40、100、160 μg/mL)的巫山神茶水溶液培养24 h,后加入20 μL的MTT(5 mg/mL),混匀,继续培养4 h,去除上层培养基,加150 μL的DMSO,黑暗、37 ℃下,振摇30 min,在490 nm处测OD值[17]。每组三个平行。

细胞存活率(%)=(Ar/As)×100

式中:Ar:巫山神茶处理组OD值;As:正常组OD值。

1.2.5 巫山神茶对过氧化氢诱导293T细胞氧化损伤的改善实验 将293T细胞悬液(1×104cells/mL)接种于96孔细胞培养板中(60 μL细胞+100 μL培养基),37 ℃培养24 h,贴壁后,加入20 μL的过氧化氢(0.3 mmol/L),培养4 h,制备氧化损伤模型。去除上层培养基后,继续加入20 μL不同浓度(0、40、100、160 μg/mL)的巫山神茶水溶液培养24 h,采用MTT法测定细胞存活率。其中,过氧化氢浓度选择[11]:预实验以0～1 mmol/L范围浓度过氧化氢处理293T细胞4 h,MTT法测其存活率。当浓度低于0.3 mmol/L时,细胞存活率先下降后上升,当浓度为0.3 mmol/L时,细胞存活率在47%±3.2%,有统计学差异(P<0.01)。因此,选择0.3 mmol/L的过氧化氢浓度开展后续实验。

1.2.6 巫山神茶对氧化应激损伤的293T细胞内MDA、SOD、GSH、GSH-PX及CAT含量影响 将处于对数生长期的293T细胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后,接种于6孔细胞培养板(1×105cells/mL)中,加入2 mL的DEME培养基,于37 ℃、5%二氧化碳含量的饱和潮湿环境中培养24 h,贴壁后,加入200 μL的过氧化氢(0.3 mmol/L),混匀,培养4 h,制备氧化损伤模型。向293T氧化损伤细胞模型中,继续每孔加入200 μL不同浓度的巫山神茶水提物(0、40、100、160 μg/mL),PBS缓冲液(0.1 mol/L)等量配平。37 ℃、5%的CO2饱和潮湿环境下培养24 h。将巫山神茶处理后的293T细胞,去除旧的培养基,经过预冷的PBS冲洗后,加200 μL胰蛋白酶脱壁,转移至1.5 mL离心管中,离心去上清。预冷的PBS再次洗涤,4000 r/min离心15 min,去除上清液。加入800 μL生理盐水,匀浆。按照相关试剂盒说明书方法测定细胞匀浆中MDA、SOD、GSH、GSH-PX及CAT含量。

表1 逆转录聚合酶链反应引物序列Table 1 The sequences of reverse transcription-polymerase chain reaction primers

1.2.7 实时荧光定量PCR法检测H2O2对293T细胞相关抗氧化基因表达的影响 将293T细胞接种到6孔板(1×105cells/mL)中,造模后用不同浓度巫山神茶处理。根据制造商的推荐,使用Trizol试剂分离293T细胞总RNA,并通过微紫外可见分光光度计在260 nm测定RNA的浓度和纯度。将各组的总RNA浓度调整至相同水平。根据制造商的建议,1 μL的Oligo(dT)18 Primer(500 ng)和1.0 μL总RNA(1.0 μg)加入10.0 μL无核酸酶水,于梯度PCR仪上65 ℃加热5 min。然后将含有4.0 μL的5×Reaction Buffer,1.0 μL的Ribolock RNase Inhibitor(20 U),2.0 μL的10 mmol/L dNTP Mix和1.0 μL的ReverAid Reverse Transcriptase(200 U/μL)的混合试剂加入到上述总RNA体系中,于42 ℃下60 min,70 ℃下5 min逆转录成cDNA。总反应体系(20 μL)由1.0 μL的cDNA,各1 μL上游和下游引物(10.0 μmol/L),10.0 μL预混物及7.0 μL无菌双蒸水组成。扩增条件如下:95 ℃变性3 min,60 ℃退火30 s,95 ℃延伸1 min,循环40次。通过RT-qPCR检测SOD、CAT、GSH及GSH-Px的mRNA表达水平。基因序列如表1所示。各基因cDNA平行扩增3次,取Ct的平均值。管家基因GAPDH用作内部参照,并且根据2-ΔΔCt计算相关基因[18]。

1.2.8 高效液相色谱法(HPLC)分析巫山神茶的主要有效成分 将巫山神茶提取物溶解于DMSO中,得到浓度为10 mg/mL的溶液,然后用50%甲醇稀释,得到最终浓度为2 mg/mL的最终浓度,过0.22 μm有机滤膜后上机测试(进样量:10 μL)。色谱柱:Accucore C18柱(2.6 μm,4.6×150 mm);流动相A:0.5%乙酸水;流动相B:乙腈;流速0.6 mL/min,柱温35 ℃,检测波长254 nm。梯度洗脱条件:0～10 min,12%～25% B;10～30 min,25%～45% B[12]。

1.3 数据处理

通过SPSS 20.0统计软件分析数据。所有实验数据重复三次,结果表示为平均值±标准偏差(SD)。使用Duncan的多范围检验通过单因素方差分析(ANOVA)分析结果,P<0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 巫山神茶体外抗氧化实验结果

在0.2、0.6和1.0 mg/mL浓度下,通过水杨酸比色法[13]测定了巫山神茶提取物对羟基自由基的清除能力(图1A),结果表明清除率分别为27.5%、41.7%和58.1%,而VC对照组的清除率为31.6%。DPPH·是一种稳定的自由基,能够接受电子或氢自由基的单电子,并成为稳定的黄色抗磁分子[19]。DPPH·清除实验(图1B)表明1.0 mg/mL提取物对DPPH自由基的清除率为78.6%,高于0.2 mg/mL(23.9%)、0.6 mg/mL(55.5%)和VC对照组(32.5%)。在0.2～1.0 mg/mL的浓度范围内,巫山神茶提取物的ABTS自由基清除能力(图1C)在25.9%到65.2%之间,与VC对照组(34.3%)有显著差异(P<0.05)。同时,通过邻苯三酚自氧化法[16]测定了巫山神茶提取物对超氧阴离子自由基(图1D)清除能力,1.0 mg/mL巫山神茶提取物清除率为87.6%,显著(P<0.05)高于0.2 mg/mL(34.2%)、0.6 mg/mL(62.7%)和VC对照组(43.5%)的清除率。综上,清除率随浓度增加而显著增强(P<0.05),表明巫山神茶对四种自由基的清除能力具有剂量依赖关系,且存在显着差异(P<0.05),这与周璐等[20]、张宏岐等[21]的研究结果相似。

2.2 巫山神茶对293T细胞毒性实验

如图2所示,经过40、100和160 μg/mL的巫山神茶提取物处理后,293T细胞存活率均超过93%,说明此浓度范围内(0～160 μg/mL)的巫山神茶对293T细胞没有明显的致死作用。郭婕等[22]研究也表明其属于实际无毒物质。因此,将40、100和160 μg/mL的巫山神茶提取物用于后续研究。

图1 巫山神茶对羟基、DPPH·、ABTS+·和超氧阴离子自由基清除能力Fig.1 Scavenging capacity of WST to hydroxyl,DPPH·,ABTS+· and superoxide anion radicals注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05);图2～图6同。

图2 巫山神茶处理对293T细胞存活率的影响Fig.2 Effect of WST treatment on survival rate of 293T cells

2.3 巫山神茶对过氧化氢诱导293T细胞氧化损伤的改善实验

如图3所示,相比于正常组细胞,经过H2O2诱导损伤的293T细胞存活率显著下降(P<0.05)。经40、100和160 μg/mL浓度的巫山神茶提取物处理后,细胞存活率显著提高(P<0.05),且高质量浓度(160 μg/mL)处理后的细胞存活率为75.6%,效果更显著(P<0.05)。

图3 巫山神茶对受损293T细胞存活率的影响Fig.3 Effect of WST on survival rate of damaged 293T cells

2.4 巫山神茶处理后的氧化损伤293T细胞中MDA含量变化

丙二醛(MDA)是体内膜脂过氧化的最终代谢产物,能较好的反映组织过氧化程度。细胞膜上释放出来的MDA可以与蛋白质、核酸反应,引起交联聚合,还可抑制蛋白质的合成,主要通过损伤膜结构及功能,改变其通透性,从而影响正常机体生化反应[23-24]。因此,MDA含量可反映机体脂质过氧化的程度,间接反应出细胞损伤程度。研究发现,摄入适当的抗氧化物质可以降低ROS引起的脂质过氧化程度[25]。如图4所示,经H2O2(0.3 mmol/L)处理4 h的293T细胞,MDA含量较正常细胞显著上升(P<0.05),在给与不同质量浓度(40、100及160 μg/mL)的巫山神茶提取物处理后,细胞内MDA含量显著下降(P<0.05),并且160 μg/mL巫山神茶处理后MDA含量最低。

图4 巫山神茶对受损293T细胞内MDA含量影响Fig.4 Effect of WST on the contents of MDA in damaged 293T cells

2.5 巫山神茶处理后的氧化损伤293T细胞中SOD、GSH、GSH-Px及CAT含量变化

人体内源性抗氧化酶CAT、SOD、GSH-Px以及非酶GSH能够有效改善氧化应激损伤[26-28]。巫山神茶可通过上调氧化应激受损细胞内的抗氧化酶(CAT、SOD、GSH-Px)及非酶性抗氧化物GSH的mRNA的转录水平,有助于增强其抗氧化活性,缓解细胞损伤。如图5所示,经H2O2(0.3 mmol/L)处理4 h的293T细胞,SOD、GSH、GSH-Px及CAT含量较正常细胞显著下降(P<0.05)。在不同质量浓度(40、100及160 μg/mL)的巫山神茶处理后,细胞内SOD、GSH、GSH-Px及CAT含量较损伤组显著提高(P<0.05),并且高剂量的巫山神茶处理后效果最好。

图5 巫山神茶对受损293T细胞内SOD,GSH,GSH-Px及CAT含量影响Fig.5 Effects of WST on the levels of SOD,GSH,GSH-Px and CAT in damaged 293T cells

图6 巫山神茶对受损293T细胞内SOD,CAT,GSH和GSH-Px基因表达影响Fig.6 Effects of WST on the gene expression of SOD,CAT,GSH and GSH-Px in damaged 293T cells

2.6 巫山神茶对受损293T细胞内SOD、CAT、GSH、GSH-Px基因表达水平影响

如图6所示,通过实时荧光定量PCR分析发现,经过H2O2(0.3 mmol/L)诱导损伤处理,293T细胞内SOD、CAT、GSH及GSH-Px的mRNA表达量显著(P<0.05)降低。经由巫山神茶提取物改善处理后,受损细胞内的内源性抗氧化酶SOD、CAT、GSH及GSH-Px的表达水平较损伤组显著增强(P<0.05),与试剂盒测试结果一致。

2.7 巫山神茶主要成分的液相色谱分析

图7、图8为标准品及巫山神茶的液相色谱图。通过高效液相色谱对比分析相关文献分析[3-4],共检测到9种化合物,1～9分别是:绿原酸(4.880 min)、表儿茶素没食子酸酯(7.330 min)、对香豆酸(10.057 min)、异槲皮苷(11.210 min)、二氢槲皮素(12.037 min)、槲皮苷(13.313 min)、黄芩苷(16.303 min)、槲皮素(19.757 min)、根皮素(23.460 min)。

图7 混合标准品液相色谱图Fig.7 High performance liquid chromatography of mixing standards

图8 巫山神茶提取物液相色谱图Fig.8 High performance liquid chromatography of WST extracts

槲皮苷、异槲皮苷广泛存在于植物中,已被证明具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、神经保护、降血压和其他生物活性[29-30]。对香豆酸是羟基肉桂酸家族的酚酸,以苯丙氨酸和酪氨酸作为前体通过莽草酸途径进行生物合成,其中的酪氨酸可转化为绿原酸、黄酮类化合物等,在次生代谢中发挥重要作用[31]。其他化合物,如绿原酸[32]、表儿茶素没食子酸酯[33]、槲皮素[34]、二氢槲皮素[35]、黄芩苷[36]、根皮素[37]也已被证明具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、保护心肌细胞以及神经保护等其他生物活性。因此,这些生物活性化学物质的存在可能是巫山神茶表现出诸多药理作用的主要原因。

3 结论