石 杨,吕珍立,刘思琪,徐冰怡,李学静,李 杰,张 会

(东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨 150030)

表1 引物序列Table 1 Primer sequence of primers used in this study

果胶是植物细胞壁中的一种多糖,由D-半乳糖醛酸通过α-1,4-糖苷键聚合而成,与纤维素、木质素等一同构成植物细胞壁[1]。果胶酶类具有高效、环保等特性,因此该类酶的生产占全球食品工业酶销售份额的75%[2],目前在食品、洗涤剂、造纸、纺织、有机化合物合成等领域的工业生产中均有较为广泛的应用[3-6]。

多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)是一种重要的酶类,在植物、真菌、细菌和少数昆虫的生命活动中起着重要作用。PG能切断果胶物质内的α-1,4-糖苷键,促进聚半乳糖醛酸链裂解[7]。根据其最适pH的差异,可将它们分为酸性酶和碱性酶。PG在食品、废水处理、动物饲料、造纸和纸浆、果汁以及纺织工业中应用广泛[8-10],如何获得高效的PG一直是研究的热点。通常,PG在较低的pH4.0～6.0,30～40 ℃ 的温度下具有最佳的活性[11],同时来源不同的PG基因所表达的酶,其最适温度也存在一定差异,在50～72 ℃范围内不等[12-14]。而通过异源表达产生的PG中,原核表达的酶活性较弱,如细菌CaldicellulosiruptorbesciiDSM6725 中获得的PG酶活为386.8 U·mg-1[13];而相比于原核表达,在真核细胞毕赤酵母中表达的PG活性相对较高,蛋白纯化后酶活在700.9～5178 U·mg-1范围内[12,14-15]。

图1 pSZHG6RS-pgaB表达载体T-DNA区域的示意图Fig.1 Schematic diagram of T-DNA region of pSZHG6RS-pgaB expression vector

黑曲霉是丝状真菌中曲霉属的一种,是多种有机酸和酶制剂的重要工业生产菌株,具有卓越的表达和分泌能力及与哺乳动物相似的糖基化修饰系统,能够正确进行蛋白质的各种翻译修饰,安全性广泛为人们所接受,是新型重组蛋白表达系统建立的理想选择,被广泛用作生产同源和异源蛋白质的宿主菌株[16-18],本课题组前期应用农杆菌介导的基因置换技术,建立了食品级黑曲霉分泌表达系统,并通过密码子优化、基因融合等策略提高重组蛋白的产量,取得了很多进展,展现出了明确的产业化价值[17-19,24-25]。但是目前利用黑曲霉菌生产PG的报道相对较少。因此,本研究以黑曲霉内源高表达的glaA位点作为基因整合的靶位点,集成glaA多拷贝强启动子和信号肽来提高PG的表达量。同时对PG的酶学性质进行研究,以期使PG的生产性能达到国内领先水平。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

果胶酶生产菌黑曲霉GJ-1、受体菌糖化酶生产菌黑曲霉TH-2 肇东日成酶制剂公司赠予;pMD-19T、Primer STAR DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、限制性内切酶 TaKaRa生物公司;根癌农杆菌AGL1、pSZHG6RS质粒 由东北农业大学真菌遗传工程研究室保存;大肠杆菌感受态DH5α北京全式金有限公司;质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、植物DNA基因组提取试剂盒、UltraSYBR Mixture试剂盒 康为世纪生物科技有限公司;苹果果胶(酯化度70%～75%)、食品级果胶(酯化度≥60%)、多聚半乳糖醛酸 Sigma公司;抗生素(氨苄霉素、卡那霉素、利福平、乙酰丁香酮、潮霉素) Sangon公司;YEB(Yeast extract beef medium) 1 g 酵母提取物,5 g蛋白胨,0.493 g MgSO4,5 g蔗糖,5 g Beef extract 定容至1 L,pH调至7.0,固体培养基加入10% Agar power,121 ℃高压灭菌1 h;发酵培养基 10 g葡萄糖,2 mL玉米浆,2 g豆饼粉定容至100 mL,pH5.0～6.0,固体培养基加入10% 琼脂粉,配制添加CPPs的发酵培养基时另加0～2% CPPs,121 ℃高压灭菌1 h;其他试剂 均为分析纯。

T960PCR仪 北京比朗实验设备有限公司;DK-8D控温水槽、SW-CJ-IFD超净工作台 上海博讯实业有限公司;UV-5800PC型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计 依据NCBI数据库黑曲霉pgaB的基因序列,应用软件DNAMAN8.0进行引物的设计,P1、P2为扩增pgaB基因的引物;P3、P4为glaA基因的同源臂引物,设计的引物如表1。

1.2.2 基因扩增 提取果胶酶生产菌黑曲霉GJ-1基因组,并以黑曲霉基因组为模板,用基因上下游引物P1和P2进行扩增,扩增出1232 bp的编码PG表达的基因pgaB。将得到的pgaB基因片段和pMD-19T载体4 ℃过夜相连,随后转入大肠杆菌受体中,提取大肠杆菌转化子的质粒,得到质粒pMD-pgaB,并用Apa Ⅰ和Hind III双酶切回收大小为1232 bp的片段。

1.2.3 表达载体的构建 将回收的目的基因片段与pSZHG6RS载体片段用T4DNA连接酶连接,23 ℃连接2 h,转化入大肠杆菌DH5α中,并用Apa I和Hind III对提取的重组质粒进行双酶切鉴定,得到表达载体pSZHG6RS-pgaB,如图1。

1.2.4 农杆介导法筛选黑曲霉重组菌株 采用冻融法将鉴定正确的重组质粒pSZH6RS-pgaB 转入农杆菌AGL1中,挑取农杆菌落作为模板,利用目的基因引物P1和同源臂引物P4进行PCR鉴定,水为阴性对照,重组质粒pSZH6RS-pgaB为阳性对照,得到pSZH6RS-pgaB农杆菌重组转化子。

挑取鉴定正确的pSZH6RS-pgaB农杆菌转化子接种于YEB培养基中(含50 mg·L-1Rif,100 mg·L-1Kan和200 μmol·L-1As),振荡培养3～6 h后,取150 μL农杆菌与打碎并静止10～15 min的黑曲霉TH-2混合,涂布于PDA固体培养基(含200 μmol·L-1As)。28 ℃条件下培养,通过同源重组将pgaB基因替换并整合到黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因glaA位点。48 h后转接至PDA筛选培养基上(含200 μmol·L-1头孢霉素,200 μmol·L-1潮霉素),进行第一次筛选。培养4～7 d后挑取生长良好的单菌落至10 mL液体PDA培养基(含200 μmol·L-1头孢霉素,200 μmol·L-1潮霉素)进行第二次筛选。培养4～7 d后收集长势良好的黑曲霉菌丝提取基因组作为模板,以水、宿主菌株TH-2为阴性对照,重组质粒pSZH6RS-pgaB为阳性对照,使用P3和P4引物进行PCR鉴定。当重组菌株只有重组表达载体质粒条带,没有受体菌株条带时,pgaB目的基因成功整合到受体菌株并且glaA基因全部被pgaB基因表达框替换[19]。

1.2.5 黑曲霉重组菌株的表达与SDS-PAGE检测 分别将鉴定正确的pgaB重组菌株和宿主菌株黑曲霉TH-2按10%接种量接种于发酵培养基中,30 ℃ 270 r/min振荡培养。分别吸取pgaB重组菌株第4～11 d和黑曲霉TH-2第7 d发酵上清液,离心并于4 ℃保存。

离心保存的样品上清液和2×protein loading buffer各取10 μL混合,煮沸5～10 min,冷却至室温后进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。浓缩胶使用80 V电压,分离胶使用130 V电压进行电泳。待结束后取下凝胶并加入适量考马斯亮蓝R-250染液,振荡染色1～2 h,然后加入脱色液振荡脱色1～2 h。

1.2.6 酶活力的测定 采用DNS法测定多聚半乳糖醛酸酶活性[20]。多聚半乳糖醛酸酶活力单位定义为:在50 ℃、pH5.0的条件下,1 mL酶液1 h降解果胶生成1 mg D-半乳糖醛酸为一个酶活力单位,即1 U。

1.2.7 重组PG的酶学性质分析 将摇瓶发酵培养的150 mL培养液于第10 d取出,在4 ℃静置过夜,收集上清。对上清液进行抽滤,去除杂质。

1.2.7.1 最适pH 取6份PG发酵液上清,分别用pH为2.8、3.6、4.4、5.0、5.6、6.4的0.2 mol·L-1Na2HPO4-柠檬酸缓冲液进行稀释,加入1%的多聚半乳糖醛酸底物,50 ℃条件下反应30 min后测定不同pH时的重组酶活力。计算各组酶活数值与最大值的比值为相对酶活力,绘制相对酶活力与的pH曲线关系,以最大酶活力为100%[21]。

1.2.7.2 pH稳定性 取7份PG发酵液上清,其中6份分别放在pH为2.8、3.6、4.4、5.0、5.6、6.4的缓冲液中,37 ℃处理1.5 h。用pH5.0的缓冲液稀释处理后的样品,加入1%的多聚半乳糖醛酸底物,50 ℃条件下反应30 min后测定PG的酶活力,另一份酶液作为对照组未经pH处理,并定义其酶活力为100%[21],计算处理组与对照组比值为残余酶活力并绘制曲线关系。

1.2.7.3 最适温度 取9份PG发酵液上清,用pH5.0的0.2 mol·L-1Na2HPO4-柠檬酸缓冲液进行稀释,加入1%的多聚半乳糖醛酸底物,分别在33、38、43、48、50、58、63、68、73 ℃的条件下反应30 min后测定PG的酶活力,计算各组酶活数值与最大值的比值为相对酶活力,绘制相对酶活力与的温度曲线关系,以最大酶活力为100%[21]。

1.2.7.4 温度稳定性 取10份PG发酵液上清,其中9份分别在33、38、43、48、50、58、63、68、73 ℃水浴锅中保温1.5 h,之后在pH为5.0,温度为50 ℃的条件下反应30 min后测定PG的酶活力;另一份酶液作为对照组不进行保温处理,并定义其酶活力为100%[21],计算处理组与对照组酶活比值为残余酶活力并绘制曲线关系。

1.2.7.5 金属离子对PG活性的影响 取9份PG发酵液上清,其中8份分别添加终浓度为5 mmol·L-1KCl、MnSO4、ZnSO4、MgSO4、CaCl2、CuSO4、FeCl3、FeSO4等不同的金属离子,在50 ℃、pH5.0条件下处理1 h,研究不同金属离子对PG酶活力的影响,另一份酶液作为对照组不加任何金属离子,并定义其酶活力为100%[22-24],计算处理组与对照组酶活比值为残余酶活力并绘制曲线关系。

1.2.7.6 柠檬酸对多聚半乳糖醛酸酶活力的影响 取8份PG发酵液上清,其中7份分别与浓度为0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的柠檬酸溶液混合,37 ℃保温1.5 h,用pH5.0的缓冲液稀释处理后的样品,加入1%的多聚半乳糖醛酸底物,50 ℃条件下反应30 min,另一份酶液作为对照组不加柠檬酸处理,并定义其酶活力为100%[21]。计算处理组与对照组酶活比值为相对酶活力并绘制曲线关系。

1.2.7.7 重组酶的底物特异性 以酯化程度不同的果胶类物质为底物,测定重组酶的催化水解能力。底物包括酯化程度66%～69%的食品果胶与70%～75%的苹果果胶,以及无酯化程度的多聚半乳糖醛酸。在pH为5.0,温度为50 ℃条件下反应过夜,以200倍稀释酶液为实验组,150倍稀释酶液为对照以确保水解充分。测定反应后溶液还原糖增加量并计算DE值[23]。

1.3 数据处理

在酶活性相关实验中,每组处理重复三次,计算得到的酶活数据利用SPSS软件进行单因素方差分析,以确定组间显著差异。

2 结果与分析

2.1 多聚半乳糖醛酸酶黑曲霉表达载体的构建

用Apa I和Hind III双酶切回收质粒pMD-pgaB得到目的基因片段,并用Apa I和Hind III双酶切回收实验室保存的载体得到pSZHG6RS载体片段。用T4 DNA Ligase将这两个片段相连,23 ℃连接2 h,随后将其转化到大肠杆菌DH5α感受态中,挑取圆滑状态的单菌落,提取转化子的质粒,构建重组表达载体pSZHG6RS-pgaB。用Apa I和Hind III双酶切鉴定,得到15831 bp的载体条带和1232 bp的目的基因条带,结果证明表达载体pSZHG6RS-pgaB构建成功,如图2。

图2 pSZHG6RS-pgaB表达载体的双酶切结果Fig.2 The results of restriction enzyme digestion of pSZHG6RS-pgaB expression vector注:M:DL15000Marker;1:pSZHG6RS-pgaB的双酶切结果(Apa Ⅰ/Hind Ⅲ)。

2.2 多聚半乳糖醛酸酶农杆菌转化子的筛选与鉴定

采用冻融法将重组质粒pSZHG6RS-pgaB 转化入农杆菌AGL1中,48 h 后挑取菌落作为模板,用pgaB基因上游引物P1和glaA基因同源臂引物P4进行菌落PCR鉴定(如图3),阴性对照水无条带,阳性对照重组质粒和农杆菌转化子都能扩增出2432 bp的目的条带,证明重组质粒pSZHG6RS-pgaB成功转化入农杆菌AGL1中。

图3 pSZHG6RS-pgaB转化入农杆菌的PCR鉴定Fig.3 PCR identification of pSZHG6RS-pgaB transferred to Agrobacterium注:M:DL5000 Marker;-:水;+:pSZHG6RS-pgaB质粒; 1:pSZHG6RS-pgaB农杆菌转化子。

2.3 多聚半乳糖醛酸酶黑曲霉重组菌株的筛选与鉴定

将PCR鉴定正确的pSZHG6RS-pgaB农杆菌转化子悬液与用匀浆器匀浆约3 min,与黑曲霉TH-2菌进行共培养,挑取长势良好的菌落于10 mL PDA液体培养基中培养,4～7 d后收集菌丝提取基因组,用引物P3、P4进行基因组PCR鉴定。水、宿主菌株TH-2为阴性对照,重组质粒为阳性对照。鉴定结果如图4,8号重组菌株没有4550 bp的glaA条带,而有与重组质粒pSZHG6RS-pgaB相同的4032 bp的条带,说明该菌株为纯合的同源重组菌株。

图4 pSZHG6RS-pgaB黑曲霉重组菌株的PCR鉴定Fig.4 PCR identification of recombinant transformation strains of pSZHG6RS-pgaB Aspergillus niger注:M:DL15000 Marker;-:水;0:宿主菌株TH-2;+:pSZHG6RS-pgaB重组质粒; 1～7:非转化子;8:纯合黑曲霉重组转化子。

2.4 多聚半乳糖醛酸酶黑曲霉重组菌株的表达

分别将宿主菌株TH-2与PG纯合同源重组菌株TH-2(ΔglaA::pgaB)按照接种比例为10%进行摇瓶发酵培养,采用DNS法测得PG最大酶活为4617.8 U·mL-1,取第4～11 d的发酵液上清10 μL进行SDS-PAGE检测,经CalMolWt软件预测,PG蛋白条带大小约为38 kDa,结果如图5所示,糖化酶在位置1处,酸稳定的α-淀粉酶在位置2处,α-淀粉酶在位置3处,与宿主菌株TH-2相比,在位置4处观察到一条明显的蛋白条带,大小约38 kDa,与预估值相似,且没有糖化酶蛋白带1,证明PG重组菌株为纯合同源重组菌株。

图5 pSZHG6RS-pgaB黑曲霉重组菌株的SDS-PAGE蛋白表达凝胶电泳图谱Fig.5 Gel electrophoresis pattern of SDS-PAGE protein expression in pSZHG6RS-pgaB Aspergillus niger注:M:180.0 kDa Protein Maker;TH-2:TH-2 宿主菌株第7 d; 4 d～11 d:6R-pgaB纯合同源重组菌株第4～11 d; 1:糖化酶蛋白带;2:酸稳定的α-淀粉酶蛋白带; 3:α-淀粉酶蛋白带;4:PG蛋白带。

2.5 多聚半乳糖醛酸酶的酶学性质研究

2.5.1 pH对重组酶活性的影响及其稳定性 不同pH条件下,多聚半乳糖醛酸酶的活性变化差异显著(P<0.05或P<0.01)(如图6a)。pH在 2.8～5.0之间酶活性呈上升趋势,并在5.0时酶活达到最大,pH在5.0～6.4时,其酶活呈现下降趋势。pH稳定性结果表明(如图6b),不同pH条件下处理1.5 h之后,酶在pH4.4左右时较为稳定。在pH低于4.4条件下,残余酶活迅速下降,稳定性较差。在pH高于4.4条件下,其残余酶活下降速度相对较慢,稳定性相对较高。

图6 pH对重组PG酶活的影响Fig.6 Effects of pH on enzyme activity of recombinant PG注:a.重组PG的最适pH;b.重组PG的pH稳定性;不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),不同小写字母表示差异显著(P<0.05);图7～图10同。

2.5.2 温度对重组酶活性的影响及其稳定性 不同温度下,多聚半乳糖醛酸酶的活性变化差异显著(如图7a),在50 ℃时,酶活达到最大值。当温度处于33～43 ℃和58～73 ℃范围内时,其酶活性相比于50 ℃显著降低。热稳定性结果表明(如图7b),不同温度处理1.5 h之后,酶在43～50 ℃范围内较稳定,残余酶活可以维持在70%以上。当高于58 ℃时,酶稳定性显著下降,残余酶活不足20%。

图7 温度对重组PG酶活的影响Fig.7 Effects of temperature on enzyme activity of recombinant PG注:a.重组PG的最适温度;b.重组PG的热稳定性。

2.5.3 金属离子对重组酶活性的影响 8种常见的金属离子对重组PG的酶活性影响差异极显著(如图8)(P<0.01)。结果表明Ca2+、Fe3+、Fe2+对酶活有显著的促进作用,其中Fe2+促进作用最大,达到了对照组酶活的215.92%。而其他的金属离子对PG有明显的抑制作用。有报道认为二价金属离子可以直接作用于果胶,通过稳定分子上含有负电荷的羧基基团,从而间接提高果胶酶活性[24]。但本实验中二价离子对酶的作用并不一致,其机理与原因有待进一步研究。

图8 各种金属离子对pSZHG6RS-pgaB黑曲霉重组菌株酶活的影响Fig.8 Effects of metal ions on enzyme activity of recombinant of pSZHG6RS-pgaB in Aspergillus niger

2.5.4 柠檬酸浓度对重组酶活性的影响 多聚半乳糖醛酸酶常用于果汁生产,而柠檬酸是蔬菜水果中酸性成分的重要来源,其中柠檬中含量最多,可达5%[21]。因此探究了不同浓度柠檬酸对重组PG酶活性的影响(如图9)。从整体上看,随着柠檬酸浓度的升高,酶活呈现由高到低的趋势。当有少量(0.1%)的柠檬酸存在时,柠檬酸对酶活具有促进作用,达到了对照组酶活的130.8%。当柠檬酸浓度达到0.5%及以上时,柠檬酸会降低PG的活性,在浓度达到4%时,酶的活性损失达到了50%以上。

图9 不同浓度柠檬酸对pSZHG6RS-pgaB黑曲霉重组菌株酶活的影响Fig.9 Effects of different concentrations of citric acid on enzyme activity of recombinant pSZHG6RS-pgaB in Aspergillus niger

2.5.5 多聚半乳糖醛酸酶的底物特异性 DE值是指溶液中还原糖占总干物质的百分率,其数值反映了酶对不同甲酯化底物的特异性程度(如图10)。实验所用的苹果果胶其甲酯化程度为70%～75%,经重组PG水解后其DE值为14.39%。食品级果胶其甲酯化的程度约为66%～69%,经重组PG水解后其DE值为20.63%。而对于无甲酯化的多聚半乳糖醛酸,经重组PG水解后其DE值为33.40%。通过对比发现,底物的甲酯化程度越高,其DE值越小,表明多聚半乳糖醛酸酶对该底物的降解能力越弱,所以多聚半乳糖醛酸酶更适用于甲酯化程度较低的底物降解。从重组PG对不同程度甲酯化的果胶底物水解能力的差异可以看出,甲酯化可以阻止重组PG作用于相应位点,从而降低水解其程度。多聚半乳糖醛酸水解后的DE值为33.40%,由此可推知,反应后的产物平均聚合度应大约为3,重组PG可以作用于聚合度大于3的半乳糖醛酸链。

图10 pSZHG6RS-pgaB黑曲霉重组菌株酶对不同底物的活性比较Fig.10 Comparison of the activities of recombinant enzymes from pSZHG6RS-pgaB Aspergillus niger with different substrates

3 结论

本研究以黑曲霉糖化酶生产菌为宿主菌,以内源高表达的glaA位点作为基因整合的靶位点,并使用内源高表达的glaA多拷贝强启动子和信号肽,采用同源重组基因置换技术,获得多聚半乳糖醛酸酶黑曲霉重组菌株,酶活达到4617.8 U·mL-1,具有明确的产业化前景。获得的重组PG最适作用pH为5.0,最适作用温度为50 ℃,Ca2+、Fe3+、Fe2+对酶活有显著的促进作用,少量的柠檬酸对酶活性也有一定促进作用,0.5%以上浓度的柠檬酸则会降低酶活;重组PG还可以作用于聚合度大于3的半乳糖醛酸链。