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(1.江苏里下河地区农业科学研究所,江苏扬州 225007;2.扬州辐照中心,江苏扬州 225007)

冷鲜鸡是指检疫合格的活鸡在政府指定屠宰点屠宰并迅速冷却,使鸡的胴体温度保持在0～4 ℃,然后分割、修整、包装,在保藏、运输和销售中始终维持0～4 ℃环境的冷鲜鸡肉[1]。但由于活鸡羽毛、内脏器官、粪便携带大量腐败菌和致病微生物,在屠宰、清洗、分割等加工过程中极易侵染冷鲜鸡酮体,同时鸡酮体富含水分,致使微生物在冷鲜鸡运输、保藏和销售等环节中大量繁殖,导致冷鲜鸡酮体易发生腐败,货架期缩短,致使其对消费者的健康造成安全隐患,在一定程度上限制了冷鲜鸡产业的发展[2-3]。因此,采取新型、高效的减菌、保质技术对于延长冷鲜鸡货架期、保证冷鲜鸡的卫生安全有重要意义。

食品辐照技术是指利用射线杀灭食品中的寄生虫、腐败菌、致病微生物,抑制新鲜果蔬的生理代谢活动,实现杀虫杀菌、抑制发芽、延缓生理过程,从而达到食品的安全保藏、延长食品货架期和保证食品卫生安全的目的[4],是一种在常温环境下对食品进行灭菌的安全、节能、高效的绿色加工方法,能够最大限度地保持食品的营养成分和感官品质[5]。目前用于食品辐照的射线主要有60Coγ-射线和能量在10 MeV以下的电子束[6]。γ-射线是由60Co原子核发生衰变而产生,电子束是指由电子加速器装置产生的低能或高能电子束流,因为两种射线的来源、类型不同,所以其对食品进行辐照而产生的辐射生物学效应也有差异。国内外研究机构对这两种射线辐照食品的研究主要集中在:杀菌效果、氧化程度以及营养感官等方面[7-12],如研究人员发现:在相同辐照剂量条件下,γ-射线比电子束对披萨中金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特氏菌的杀菌效果好[13],但两种辐照方式都能显著杀灭这两种微生物;两种射线辐照对腌制短颈蛤中的金黄葡萄球菌、单核增生李斯特菌以及副溶血性弧菌等致病菌都有显著的杀灭效果,但是γ-射线灭菌效果比电子束更有效[14]。虽然国内外有学者报道了γ-射线对冷鲜鸡辐照相关研究[15-16],但是有关上述两种射线辐照处理对冷鲜鸡微生物菌群多样性影响异同性的研究却未见报道。

在前期冷鲜鸡辐照保藏研究工作基础上[15,17-19],研究两种射线辐照处理对冷鲜鸡微生物含量杀灭效果、菌群多样性及群落结构变化规律的异同性,可以为冷鲜鸡贮藏过程质量安全控制提供理论基础,并为建立一种新型、安全、高效的冷鲜鸡保鲜技术体系提供科学依据和技术支持,加快推进冷鲜鸡市场服务范围。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷鲜鸡 江苏省家禽科学研究所提供的屠宰型冷鲜鸡配套系,活鸡经放血、褪毛、净膛后,将整只光鸡淋洗、沥干,在1 h内将其中心温度冷却至0～4 ℃后进行真空包装[1],于4 ℃恒温条件贮藏备用;QIAamp细菌基因组试剂盒 凯杰企业管理上海有限公司。

PYX-DHS.500BS型隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械有限公司;YX280B型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅 上海三申医疗器械制造有限公司;SW-CJ-1F型单人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司;DQB-36型多功能真空包装机 上海青葩食品包装机械有限公司;BCD-251WDBD型电冰箱 青岛海尔股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 辐照处理 选择60Coγ-射线及高能电子束为辐射源,对样品按平均吸收剂量2.5 kGy辐射处理。在扬州辐照中心使用100万居里辐照装置进行60Coγ-射线辐照,剂量率为1667 Gy·h-1,辐照时间为90 min;在扬州扬福科技有限公司10 MeV电子加速器进行高能电子束辐照,扫描宽度为700 mm,束流能量为1600 uA,束下传输速度为95 mm/s,扫描时间为23 s。

将经真空包装的冷鲜鸡样品置于4 ℃下保藏,用于菌群鉴定的冷鲜鸡样品取样后置于-80 ℃下贮藏。

对照样品:真空包装、未辐照处理、4 ℃下保藏的冷鲜鸡样品,贮藏0 d时标记为CK-0,贮藏5 d时标记为CK-1,贮藏10 d时标记为CK-2,贮藏15 d时标记为CK-3。

γ-射线辐照处理组:真空包装、γ-射线辐照处理、4 ℃下保藏的冷鲜鸡样品,贮藏5 d时标记为γ-1,贮藏10 d时标记为γ-2,贮藏15 d时标记为γ-3。

电子束辐照处理组:真空包装、电子束射线辐照处理、4 ℃下保藏的冷鲜鸡样品,贮藏5 d时标记为EB-1,贮藏10 d时标记为EB-2,贮藏15 d时标记为EB-3。

1.2.2 菌落总数测定 以无菌操作取鸡肉25 g,剪碎,置于225 mL无菌生理盐水中,均质并稀释,吸取上清液,按平板计数法测定细菌菌落总数[20]。

1.2.3 菌群鉴定和结构分析 提取样品中菌群总DNA,PCR扩增16S rDNA v3-v4区基因片段,对目的基因进行序列测定,测序工作在上海欧易生物医学科技有限公司完成。对获得的序列进行比对,序列比对分析软件为PyNAST,运用FastTree软件对进化树进行构建,获得试材中含有的菌群结构信息。

1.3 数据处理

采用PyNAST软件对基因进行序列比对,采用FastTree软件建立系统发育树,采用SPSS软件和Data Processing System软件进行数据处理、分析,显著水平取P<0.01(差异极显著)或P<0.05(差异显著)。

2 结果与分析

2.1 γ-射线与电子束辐照对冷鲜鸡菌落总数的影响

辐照对微生物会造成杀灭效果,主要是通过初级和次级作用杀灭微生物,初级作用主要是射线直接作用于生物大分子上,引起生物大分子结构发生变化而丧失功能,导致微生物死亡;次级作用是射线照射于细胞间质,引起细胞内的水分子产生大量的自由基,引起生物大分子的过氧化作用,从而导致细胞凋亡[4]。

表1 γ-射线与电子束辐照冷鲜鸡后菌落总数随贮藏时间的变化(lg(CFU/g))Table 1 Effect of γ-ray and E-beam irradiation on TVC in cold fresh chicken during storage period(lg(CFU/g))

表2 样品序列统计表Table 2 Statistics of sequence number of samples

菌落总数是鲜禽产品品质的重要微生物指标,由表1可知,对照组菌落总数在贮藏期内呈上升趋势,且在第5 d已超过《鲜、冻禽产品》[21]国家标准卫生要求,不能食用。在0～15 d内,两种射线处理组的菌落总数都低于同期对照组且差异显著(P<0.05),说明两种射线对冷鲜鸡内的微生物都产生了显著(P<0.05)杀灭作用,且在相同剂量条件下,电子束对冷鲜鸡辐照杀菌效果较γ-射线显著(P<0.05),李新等[22]研究发现,猪肉经过电子束和γ-射线辐照后细菌总数显著下降,相同剂量条件下,电子束辐照杀菌效果较γ-射线显著,这与本试验中得出的结论一致。Park等[23]利用2.5 MeV电子加速器和γ-射线采用相同辐照剂量对牛肉香肠进行辐照处理后发现,γ-射线处理组比电子束处理组在降低菌落总数方面更有优势,这与本试验发现结果不一致。分析原因,可能是前人采用的电子加速器功率较本试验中电子加速器低,造成电子束束能低,穿透能力弱,导致电子束杀菌效果受到限制。γ-射线与电子束比较杀菌效果高低时应将电子束能量(高、低)、功率(大、小)、辐照加工工艺参数(被辐照物品摆放方式,单、双面辐照)等因素考虑进去。电子束与γ-射线处理组的菌落总数在第15 d时均低于1×106CFU/g,符合国家卫生标准要求,说明两种射线处理都可以显著改善冷鲜鸡的贮藏时间。

2.2 序列的测序与统计

为保证序列分析结果的准确性,从测序得到的原始序列中去除含有模糊碱基、单碱基高重复区的序列以及长度过短的序列,并去除序列中的嵌合体序列,原始序列精准去杂后得到最终用于后续分析用的优质序列。表2为10个样品中有效序列和优质序列的统计结果,优质序列占比最低为69.00%,最高为93.86%,表明测序得到的序列结果符合生物多样性分析的要求。

2.3 冷鲜鸡贮藏过程中细菌群落结构及动态变化

2.3.1 基于门水平的微生物群落结构分析 图1是基于门绘制的微生物群落结构变化图,从图1中可以看出所有的样品细菌群落可以分为9个门,其中变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)的微生物占了较大的比例。未辐照冷鲜鸡贮藏0 d时的主要微生物为Proteobacteria和Firmicutes,分别占到71.09%和21.85%,其次为Fusobacteria和Bacteroidetes,所占比例为5.15%和1.72%,4种微生物的丰度总和达到99.82%,其它5种不同门的微生物只占有很小的比例。随着贮藏时间和辐照射线种类的不同,基于门的微生物群落结构发生了变化。

图1 基于门的细菌群落结构变化Fig.1 Bacterial community distribution at the phylum level

未辐照冷鲜鸡内的Proteobacteria丰度随着贮藏时间的延长而显著(P<0.05)增加,贮藏0 d时丰度为71.09%,贮藏5 d上升为78.85%,贮藏10 d上升为94.56%,15 d时达到97.49%,成为优势腐败菌;Firmicutes丰度在整个贮藏期内都呈下降趋势,从21.85%下降到2.35%(15 d);Fusobacteria丰度从5.15%(0 d)下降到0.07%(5 d),之后虽然上升为0.13%(10 d),但在贮藏末期时比例依旧很低(0.03%,15 d)。

冷鲜鸡经过γ-射线辐照后,Proteobacteria丰度5 d时为90.47%,10 d时丰度下降到84.83%,15 d时丰度小幅上升至85.62%,与未辐照冷鲜鸡一样,在整个贮藏期内都是优势腐败菌。但Firmicutes丰度变化情况与CK组Firmicutes丰度在整个贮藏期内都呈下降趋势不同,γ-射线处理组内冷鲜鸡的Firmicutes丰度从9.26%(5 d)下降到1.33%(10 d),随后丰度显著上升至5.97%(15 d)。Fusobacteria丰度变化很大,从0.0027%(5 d)大幅上升为11.89%(10 d),15 d时下降到8.15%。

高能电子束辐照处理冷鲜鸡后,Proteobacteria丰度5 d时为77.55%,10 d时大幅上升至91.24%,在15 d时小幅下降至88.47%,但在整个贮藏期内都占有较大比例,成为优势腐败菌;Firmicutes丰度在整个贮藏期内变化不大;但Fusobacteria丰度变化趋势与Proteobacteria相反,呈先下降后升高趋势。

Bacteroidetes丰度在冷鲜鸡所有样品中所占比例较小,未辐照冷鲜鸡Bacteroidetes丰度值随着贮藏时间的延长呈下降趋势,从1.72%(0 d)下降至样品贮藏末期0.09%(15 d);γ-射线处理组Bacteroidetes丰度随贮藏时间变化不大,5 d 时为0.20%,15 d时为0.21%;电子束处理组Bacteroidetes丰度变化不大,5 d时丰度为0.14%,贮藏末期15 d时为0.16%。

由此可知,在冷鲜鸡整个贮藏过程中,Proteobacteria、Firmicutes和Fusobacteria都是优势菌群,其中Proteobacteria为占有绝对优势的腐败菌。两种射线处理在有效杀灭微生物的同时,冷鲜鸡内微生物群落结构也发生了变化。与CK组相比,γ-射线辐照处理可以抑制Proteobacteria的生长,对Fusobacteria有促进生长作用,而Firmicutes丰度在贮藏中期出现下降,在贮藏后期又出现升高现象,这可能与微生物之间的繁殖竞争有关,因为两者丰度变化趋势完全相反。电子束辐照处理没有对Proteobacteria的生长产生抑制作用,对Firmicutes无显著抑制作用,这可能是由于Firmicutes会产生芽孢,而芽孢可以抵御γ-射线和电子束射线的辐照,在辐照后的贮藏期内芽孢复苏、繁殖的缘故[24]。

2.3.2 基于属水平的微生物群落结构分析 图2～图4是基于属水平的冷鲜鸡微生物群落结构变化图,可以更直观的看出冷鲜鸡内微生物随着辐照射线种类的不同,以及随着贮藏时间的变化而发生的群落结构动态变化。本试验共鉴定出62个属的细菌,表明冷鲜鸡菌落形态较为丰富。图2可知,未辐照冷鲜鸡0 d时丰度大于1%的菌属有9个,环丝菌属(Brochothrix)丰度达到18.59%,占优势地位,但随着贮藏时间的变长,丰度大于1%的菌属数量逐渐变小,15 d时丰度大于1%的菌属只有4个,而嗜冷菌属(Psychrobacter)丰度达到24.79%,与目前大多数冷鲜肉优势腐败菌研究结果一致[25-28]。

图2 基于属水平的冷鲜鸡微生物群落结构(CK组)Fig.2 Bacterial community distribution at the genus level(CK group)

γ-射线辐照处理组冷鲜鸡群落结构变化趋势为丰度大于1%的菌属随着贮藏时间的延长而更加丰富,与CK组呈相反变化趋势。5 d时丰度大于1%的菌属有3个,嗜冷菌属(Psychrobacter)丰度为22.05%;10 d时嗜冷菌属丰度出现下降现象,不动细菌属(Acinetobacter)丰度大幅上升至29.65,处于优势地位;15 d时丰度大于1%的菌属上升为8个,希瓦氏菌属(Shewanella)丰度大幅上升至33.40%,成为优势菌群。

高能电子束对冷鲜鸡辐照处理后,丰度大于1%的菌属数随着贮藏时间的延长变化不显著,希瓦氏菌属(Shewanella)在整个贮藏期内都是优势菌群,希瓦氏菌属(Shewanella)5 d时丰度为38.75%,贮存至10 d时比例下降至36.53%,15 d时,希瓦氏菌属(Shewanella)比例上升至45.92%。

图3 基于属水平的冷鲜鸡微生物群落结构(γ-射线处理组)Fig.3 Bacterial community distribution at the genus level(γ-ray group)

希瓦氏菌属是典型的腐败菌,其低温环境适应能力强,是冷藏禽畜肉中常见的优势菌,具有很强的产生氨等腐败产物的能力[29-33],Gill等[34]报道称希瓦氏菌属是冷链流通中高水分蛋白食品的特定腐败菌,肖英平等[35]采用涂抹法和冲洗法对冷鲜鸡表面微生物进行采集分析表明,希瓦氏菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、嗜冷杆菌属和环丝菌属为优势菌属,本研究发现在贮藏末期(15 d)时,两种射线处理组内的希瓦氏菌属(Shewanella)都成为了优势腐败菌,与以上研究报道一致。以上发现的腐败菌主要是在冷鲜鸡屠宰、加工、包装、运输及销售等过程中污染了鸡酮体,且在冷藏过程中大量繁殖,最终导致了冷鲜鸡腐败变质[36-37]。

图4 基于属水平的冷鲜鸡微生物群落结构(电子束处理组)Fig.4 Bacterial community distribution at the genus level(EB group)

表3 生物多样性指数表Table 3 Alpha diversity metrics of different samples

2.4 冷鲜鸡贮藏过程中细菌群落的Alpha多样性分析

表3为冷鲜鸡微生物Alpha多样性指数表。Chao1、Observed Species为群落丰度指数(community richness),指数越大,群落丰度越高;Shannon 指数包含着物种数和各种间个体分配的均匀性两个部分,Shannon值越大,样品多样性越高,个体分配越均匀;Simpson指数是评价群落多样性的常用指数之一,Simpson指数值越高,表明群落多样性越高;Good’s Coverage也是群落多样性指数的一种,该指数反映测序深度,指数越接近于1,说明测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种。

由细菌群落的Alpha多样性分析表明,不同处理组冷鲜鸡的Good’s Coverage指数均十分接近于1,表明本试验测序深度已经基本覆盖到冷鲜鸡中的所有微生物,且不同处理方式对冷鲜鸡细菌群落组成发生了较大的变化。随着贮存时间延长,CK组的Chao1指数、Observed Species稀释曲线先增加后降低,而Shannon指数和Simpson指数的变化趋势更加明显,在整个贮存期内都呈下降趋势,说明某些嗜温性细菌在低温环境中的生长状态逐渐被抑制,导致其在贮存后期生长受阻,丰度和多样性也逐渐降低。

γ-射线辐照处理组与CK组相比,Chao1指数、Observed Species稀释曲线、Shannon指数和Simpson指数变化趋势一致,都是随贮存时间延长而逐渐升高,表明细菌群落的丰度逐渐变高且具有更高的多样性。结合图3的分析结果,说明γ-射线对原本占有生存优势的嗜冷微生物产生了抑制生长的作用,并在贮藏期间使嗜冷微生物的丰度逐渐下降至不占优势的地位。

与CK组5 d时相比,电子束处理组在贮藏5 d时细菌多样性和丰度(Chao 1和Observed Species)处于低位状态,表明电子束处理组的细菌菌落结构在贮藏初期时较为简单。在贮藏10 d时出现了(Chao 1和Observed Species)快速上升的现象并能够一直保持至贮藏后期,而Shannon和Simpson 指数在整个贮藏期内都具有较高数值且保持稳定,说明电子束处理组的细菌菌落在贮藏中期时变得更为丰富,具有更高的多样性。结合图4的分析结果,说明电子束射线在辐照初期对嗜冷微生物的生长产生了强烈的抑制作用,提高了其它原本不占生存优势细菌的生存能力,并能够一致维持微生物群落结构的稳定。

2.5 冷鲜鸡贮藏过程中细菌群落的主成分分析

由图5可知,CK组不同贮藏期样品的微生物组成差异较大,其中CK-3菌落总数最高且群落结构简单,优势腐败菌群占有绝对优势。γ-射线处理组不同贮藏期样品的微生物组成特点与CK类似,微生物组成差异也较大,γ-1的微生物组成与CK-3最为接近,说明γ-射线辐照冷鲜鸡后,贮藏早期时含有的腐败菌群与CK组贮藏末期时的组成相似,不利于冷鲜鸡的保鲜。电子束处理组不同贮藏时期的样品与CK组都相距较远,组成差异很大,且随着贮藏时间的延长电子束处理组样品的微生物组成与CK-3差异越大;EB-2与EB-3的微生物组成较为接近,可认为是一个群体,EB-1则和这个群体的组成有一定的差别且与CK-1距离较远,说明电子束辐照冷鲜鸡后能够有效降低菌落总数的同时,在贮藏早期时就可以有效杀灭导致冷鲜鸡腐败的优势腐败菌群,这十分有利于冷鲜鸡的贮藏保鲜。

图5 冷鲜鸡细菌群落贮藏过程中主成分分析Fig.5 Principal component analysis of microorganism in cold fresh chicken during storage

3 结论

冷鲜鸡经γ-射线和电子束辐照后,菌落总数显著(P<0.05)下降,且电子束处理组比γ-射线辐照处理组灭菌效果更好;冷鲜鸡样品经高通量测序后得到了9门,62属的菌群结构,在门水平上,冷鲜鸡对照组和两个射线处理组在整个贮藏过程中变形菌门(Proteobacteria)都是绝对优势菌群。在属水平上,对照组冷鲜鸡在贮藏早期时希瓦氏菌属(Shewanella)相对丰度占有优势,但到了贮藏后期时嗜冷菌属(Psychrobacter)成为优势菌群;γ-射线组冷鲜鸡随着贮藏时间的延长希瓦氏菌属(Shewanella)和不动细菌属(Acinetobacter)成为优势菌群;电子束射线组冷鲜鸡希瓦氏菌属(Shewanella)和不动细菌属(Acinetobacter)在整个贮藏期内都是优势菌群;通过Alpha多样性分析,CK组群落丰度和多样性随着贮藏时间延长而先升高后降低,而两种射线处理组则是趋势一致,微生物群落多样性都随贮存时间延长而逐渐升高,这为辐照应用于冷鲜鸡保藏提供了科学依据。