王维佳 李萌鑫

摘要 介绍当下流行的基因编辑技术的发展现状以及在农业领域的具体应用，对于种子性状改良与市场价值进行文献梳理，试图说明基因编辑在农业育种上的发展趋势，除了TALEN（transcription activatorlike effector nucleases）和ZFN（zinc finger nuclease）这两类常用的基因编辑工具外，CRISPR-Cas9（CRISPR-associated protein 9）是目前最为流行的工具，目前已经通过 CRISPR/Cas9 改变多项农作物性状，如花色调控、延长橱架寿命、抗杀草剂、提升抗逆境能力、增加抗病性等。由于利用CRISPR/Cas9创造的作物通过孟德尔遗传分离后，不含其他生物的外源基因，因此不受基因改造法规的限制，成为科学界研究与开发的最新利器。我国一向高度重视并取得一系列成果，但是对于最新基因编辑技术的文献梳理相对较少，该研究主要贡献是结合最新资料阐述基因编辑技术在农业育种领域的应用，为我国发展基因编辑技术提供文献参考。

关键词 基因编辑技术;CRISPR/Cas9;农业育种

中图分类号 Q943.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）03-0018-08

Abstract We introduced the current development of gene editing technology and its specific application in the field of agriculture， combed the literature of seed character improvement and market value， and tried to explain the development trend of gene editing in agricultural breeding.In addition to the commonly used gene editing tools such as TALEN and ZFN， CRISPR/Cas9 is currently the most popular tool， and has now changed a number of crop traits through CRISPR/Cas9， such as flower color regulation， extend shelf life， antiherbicide， improve resistance to stress， increase disease resistance， etc.Since the crops created by CRISPR/Cas9 are isolated through Mendel inheritance and do not contain exogenous genes of other organisms， they are not restricted by genetic modification regulations and have become the latest sharp tool in scientific research and development.China has always attached great importance to and achieved a series of results， but the literature on the latest gene editing technology is relatively less combed. The main contribution of this paper is to combine the latest data to explain the application of gene editing technology in the field of agricultural breeding， and provide literature references for the development of gene editing technology in China.

Key words Gene editing technology;CRISPR/Cas9;Agricultural breeding

隨着全球人口数量增加，极端气候所造成粮食作物生产面临频繁的生物与非生物不可抗力的干扰，对于农业育种技术的改良显得尤为重要。基因编辑技术在近几年来发展迅速，此技术可针对选定的基因目标区域序列进行编辑，经过编辑后的目标序列可产生缺失、插入或置换等形式的突变，这些变异形式都具有可遗传性。目前基因编辑技术中CRISPR/Cas9系统已经应用于许多植物上，该研究将介绍此技术应用于农业育种的现状，其中包含主要粮食作物水稻、小麦与玉米等。依照不同作物的性状，基因编辑不仅能准确地对目标基因进行诱变，而且可有效地同时针对多个目标基因或运用于多倍体基因组使序列产生变异。将基因编辑技术应用于作物上可协助创造出更多耐逆境的品种，为解决全球粮食安全问题提供新思路。

1 新兴基因编辑技术现状

近年来新兴基因编辑技术如CRISPR系统、TALENs、ZFN、ODM等（表1），通过诱发突变辅助育种，诱导生物不表现特定基因片段等方法达成目的。ZFN是1996年发现可以辨认基因特定位置并截切的酵素，其特点是定点核酸酶（site directed nuclease，SDN），具有辨识特定核酸序列及使双股DNA断裂的功能，利用这种技术概念为基础[1]，后续研究发现ODM、TALENs及CRISPR等技术都可以使特定序列产生断裂，继而诱发细胞中DNA自我修复机制造成改变[2-3]。而不同于基因改造所造成的不确定性状，基因编辑技术可使用“非人为转入外源基因”方式改良传统育种技术，降低新品种开发成本与提高效率，相比传统诱变技术更快、更精准地掌握特定性状，在培育新品种时可大大提高效率。

已知的3种最受欢迎的基因编辑技术CRISPR、TALENs、ZFN，应用最多的还是生物工程领域（图1），但是，最近几年在农作物与经济类作物中的应用逐年增加并日趋成熟。自 CRISPR-Cas9 技术发展以来，基因编辑改良植物性状是主要通过 CRISPR-Cas9 产生的双链断裂来诱导突变而实现的。

2 基因编辑技术在农作物领域的应用

基因编辑技术具体分为3种典型的工具：ZFN、TALEN和CRISPR，而其中CRISPR由于操作简便、通用性强，引起学界广泛关注并获得巨大发展。2012年，美国加州大学伯克利分校正式提出利用CRISPR-Cas系统可实现基因编辑[2] 。

2.1 具体技术分析

2.1.1 CRISPR。

目前CRISPR应用作物除模式植物阿拉伯芥和烟草外，还包括大宗作物，如水稻、小麦，以上2种作物以开发新抗病或耐逆境品种为主要研究方向，如抗白粉病小麦、抗白叶枯病水稻等，其他作物还包括玉米、高粱、番茄、地钱、柑橘、大豆等，目前已有提高waxy corn支链淀粉（amylopectin）含量的基因编辑品种上市，除一般作物外，CRISPR还应用在真菌类上，如抗褐化的蘑菇，目前有许多厂商正积极开发相关作物，并已有相关产品通过认定准备上市。

安徽农业科学 2020年

2.1.2 TALENs。

TALENs应用的作物除了植物阿拉伯芥及烟草外，还包括水稻、番茄、小麦、大豆和马铃薯等，在水稻部分还开发出抗白叶枯病水稻，在番茄部分则是进行生长激素调控的研究，而马铃薯也有降低褐变速率及减少丙烯酰胺（acrylamide）产生的品种上市。

2.1.3 ZFN。

ZFN-1模式以植物烟草为主，另外也有使用抗除草剂ALS（acetolactate synthase）基因突变或带有筛选目标的基因GUS（bet aglucuronidase gene）或GFP（green fluorescent protein）植株;ZFN-2应用于模式植物阿拉伯芥及带有突变基因GUS植株。

目前基因编辑技术的应用系统包含同源性重组（homologous recombination，HR）、重组酶（recombinase）基因置入、寡核苷酸（oligonucleotide）标靶突变及核酸酶（nuclease）标靶突变等（表2）。近期研究趋向于开发应用核酸酶系统，主要包含ZFN、TALENs、MGN及CRISPR/Cas技术平台。但就便利性、操作性及效率性来看，CRISPR/Cas系统成为近几年脱颖而出的技术平台，除了专利发明的数量增加外，其投入成本也相对较低，其中2013年建立的在线CRISPR数据库更是提升了此平台的使用性及普及性，在近期内也累积了相当多的与之相关的研究成果，同时也有部分产品被开发应用，如陶氏杜邦（Dow Du Pont）通过CRISPR/Cas技术平台开发新型改良后的糯玉米（waxy corn）品种，产量问题得以解决，并已取得美国农业部动植物健康检验局（USDAs Animal and Plant Inspection Service）的批准，目前已进入田间试验阶段并有望在市场销售。

2.2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术应用现状

CRISPR/Cas9技术是目前应用最为广泛的技术。CRISPR系统可分为3种类型，第一类型与第三类型的CRISPR系统需要复杂的Cas蛋白质复合体与crRNA结合，才能辨识并剪切目标片段;第二类型的CISPR系统，也就是CRISPR/Cas9，只需要Cas9蛋白质和crRNA与反式活化CRISPR来源RNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）形成复合体，即可辨识并剪切目标片段[4-6]。2012年将crRNA与trac rRNA合为一条sgRNA（single guide RNA），减少CRISPR/Cas9系统建构的复杂度，经测试，仍具有辨识并剪切效果，使CRISPR/Cas9系统成为近几年来最热门的基因编辑工具[2-3];而我国2013年初，率先利用CRISPR技术实现了对真核细胞基因组的编辑[7]。

CRISPR/Cas9技术在动物研究领域得以蓬勃发展。植物细胞因具有细胞壁，Cas蛋白质与sgRNA，无法通过动物细胞用的显微注射法（microinjection）或电穿孔法（electroporation）送入细胞，必须将Cas9与sgRNA构筑于DNA载体，再以农杆菌媒介编辑法（agrobacteriummediated transformation）或基因枪法（particle bombardment）送入植物基因组中，使Cas9与sgRNA编辑植物基因组中的目标序列。应用CRISPR/Cas9于植物的报导最早出现在2013年[8-9]。2013—2015年CRISPR/Cas9系统在植物领域初步使用，直至2015年之后才开始出现明确应用CRISPR/Cas9于作物育种的报导。CRISPR/Cas9系统初期研究中，多以阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）、邊沁烟草（Nicotiana benthamiana）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、小麦（Triticum aestivum）等植物为主。少部分的研究使用甜橙（Citrus sinensis L.“Valencia”）[10-11]、番茄（Solanum lycopersicum）[12]等园艺作物为CRISPR/Cas9系统的材料。初期的研究多采用农杆菌渗入法（agroinfiltration）或PEG媒介原生质体转型法（PEG-mediated protoplasts transformation），使CRISPR/Cas9产生的基因组编辑发生于T0世代。Feng等[13]以CRISPR/Cas9使12个阿拉伯芥的基因发生突变，突变的基因可遗传至T3世代。Hsu[14]以CRISPR/Cas9编辑水稻的11个特定基因，这些由CRISPR/Cas9诱发的T0世代突变基因，可遗传至T1世代。以CRISPR/Cas9编辑后的基因遵守孟德尔遗传定律，可遗传至植物子代，因此CRISPR/Cas9适合应用于作物育种与探索植物基因的功能。

2.2.1 改变花色。

花青素（anthocyanin）为构成花卉色彩的色素之一。通过CRISPR/Cas9默化烟草（Nicotianatabacum）与夏堇（Torenia fournieri Linden）的黄烷酮3-羟化酶（flavanone3-hydroxylase，F3H）基因，能使烟草与夏堇的花呈现白色[15]，与Zuker等[16]以RNA干扰（RNA interference，RNAi）使康乃馨（Dianthus caryophyllus L.）的F3H基因默化的结果相符。

2.2.2 提高抗逆境能力。

ARGOS基因为植物乙烯传导途径的负调节因子，为了降低编辑玉米对乙烯的敏感度，通过转移玉米（Zeamays）的UBIQUITIN1启动子驱动的ARGOS8基因，在玉米中过量表达ARGOS8基因，结果在干旱逆境下，对比对乙烯不敏感的玉米的谷粒产量，比非基因编辑的玉米高[17]。通过419种玉米自交系筛选出内生ARGOS8 mRNA产量高的玉米品系，但所有自交系的玉米内生ARGOS8 mRNA产量都低于编辑UBIQUITIN1∷ARGOS8的玉米。该团队利用CRISPR/Cas9，将玉米内生ARGOS8的启动子，以同源重组修复的方法，置换为玉米中可连续表现的GOS2启动子，增加ARGOS8的mRNA表现量。结果显示，在开花阶段出现缺水逆境时，GOS2∷ARGOS8玉米的谷粒产量比野生型玉米的谷粒产量高[18]。

2.2.3 延长寿命与改善品质。

番茄的RIN（RIPENIN GINHIBITOR）基因会促使番茄果实后熟，诱导内源乙烯增生、增加茄红素（lycopene）的生成量、降解叶绿素（chlorophyll），缩短番茄果实的保质期[19]。野生型番茄的果实在转红阶段（breaker stage）后5 d呈现橘红色，然而通过CRISPR/Cas9使RIN基因突变的番茄果实只呈现黄色。显示利用CRISPR/Cas9可以使果实后熟相关基因默化，延长果实保质期[20]。美国宾州州立大学的物病理学家杨亦农利用CRISPR/Cas9敲除蘑菇（Agaricus bisporus）其中一个多酚氧化酶（poly phenol oxidase，PPO）基因的功能，使该种PPO活性降低30%，达到推迟蘑菇褐化速度的目的。杜邦先锋国际种子公司（Du Pont Pioneer）利用CRISPR/Cas9将糯玉米（waxy corn）（Zeamays L.sinensis Kulesh）内生的Wx1基因敲除。Wx1基因可转译出胚乳淀粉粒结合性淀粉合成酵素（endosperms granulebound starchsynthase），使糯玉米产生较多的直链淀粉（longchain poly saccharide）。敲除Wx1基因的糯玉米只产生支链淀粉（branched poly saccharide amylopectin），排除直链淀粉胶化的情形。

2.2.4 抗除草剂。

硫酰尿素类除草剂（sulfonylurea herbicides）能抑制植物的乙酰乳酸合成酵素（aceto lactate synthase，ALS），导致属于支链氨基酸的缬氨酸（valine）、白氨酸（leucine）、异白氨酸（isoleucine）无法合成。将阿拉伯芥与大豆（Glycine max）ALS基因上特定位点的脯氨酸（proline）改为丝氨酸（serine），可使植株对硫酰尿素类除草剂Chlorsulfuron具有抗性[1，21]。利用CRISPR/Cas9使玉米的ALS2基因产生DSB，将第165个脯氨酸改为丝氨酸的ALS2单股模板以同源重组修复的方式进入玉米基因组，对玉米喷洒100 mg/L Chlorsulfuron 21 d后，仍可正常生长[22-23]，同时Sun[22]以相同的方式编辑水稻的ALS基因，将水稻ALS基因第548个及627个氨基酸密码子分别由色氨酸（tryptophan）及丝氨酸改为白氨酸与异白氨酸，利用CRISPR/Cas9使改变过的单股ALS基因置换水稻内生的ALS基因，可惜没有成功。进一步将改变过的ALS基因与sgRNA及Cas9构筑于同一DNA载体上，通过基因枪编辑法与农杆菌编辑法将此构筑送入水稻愈伤组织，再于含除草剂双草醚的培养基上筛选，成功获得抗双草醚的水稻植株[22-23]。

2.2.5 抗真菌性。

DMR6（downy mildew resistant6）基因解码为2-oxoglutarateFe（Ⅱ）oxygenase。阿拉伯芥突变体dmr6中，抗病相关基因与水杨酸（salicylic acid）的含量均显著提高，使露菌病菌、假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）、番椒疫病菌（Phytophthora capsici）较不易感染阿拉伯芥[23]。以CRISPR/Cas9使番茄的DMR6（SlDMR6）基因产生5個与7个核苷酸缺失，引起移码突变，造成DMR6转译的蛋白质失去功能[24]。经病原菌接种试验后显示，由CRISPR/Cas9产生的dmr6番茄突变株对假单胞杆菌及番椒疫病菌具有抗性，突变株与野生型番茄的株高无显著差异。

稻热病（rice blast）由稻热病菌（Magnaporthe oryzae）引起。稻热病会使水稻产量减少，造成稻农受到严重的损失。OsERF922基因突变会使水稻抗稻热病的相关基因表现量提高，使水稻不容易感染稻热病。以RNAi技术默化水稻OsERF922基因，可以增加水稻对稻热病的抗病性[25]。通过CRISPR/Cas9 默化水稻的OsERF922基因也能增强水稻对稻热病的抗病性。将以CRISPR/Cas9获得的抗稻热病水稻自交，使突变的OsERF922基因与带有Cas9/sgRNA的T-DNA（transfer DNA）分离，获得只带有OsERF922突变基因的T2世代抗稻热病水稻。T2世代抗稻热病水稻的株高、结实率及种子千粒重等农艺性状与野生型的水稻间无显著差异[11-13，25]。显示经CRISPR/Cas9 只编辑植物的目标基因，并不影响植物的其他基因。

2.2.6 抗病性。

以农杆菌渗入法将番茄黄化卷叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）复制起始点（origin of replication）的sgRNA表现于编辑Cas9内切酶（Cas9 endonuclease）基因的边沁烟草，再接种TYLCV。TYLCV的基因组DNA于植株内的累积量受到CRISPR/Cas9系统的干扰而有效地减少[26]。为观察CRISPR/Cas9系统表现活性，将菜豆黄矮病毒（bean yellow dwarf virus，BeYDV）载体中的移动蛋白（movement protein）与外鞘蛋白（coat protein）基因，以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因取代，并与有Cas9及BeYDVsgRNA的构筑共同编辑野生型边沁烟草对比[27]。BeYDV病毒载体受到Cas9与sgRNA表现影响，病毒载体所表达的GFP讯号强度减弱，显示CRISPR/Cas9技术可有效干扰植物病毒的基因。植物的真核转译作用起始因子4E（eukaryotic translation initiation factors，eIF4E）可与mRNA的5′端帽（5′-terminal cap）作用，参与mRNA转译[28]。eIF4E与马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的病毒蛋白基因组结合（viral protein genomelinked，VPg）蛋白，可协助Potyvirus完成病毒的生命周期。编辑Cas9与eIF4E亚型（eIF（iso）4E）的sgRNA至阿拉伯芥，使eIF（iso）4E突变。eIF（iso）4E阿拉伯芥编辑株经自交分离后，获得纯型合子且非基因编辑的eIF（iso）4E阿拉伯芥突变株T2世代。经接种芜菁嵌纹病毒（Turnip mosaic virus）后，eIF（iso）4E突变株表现抗病性[29]。Chandrasekaran等[30]、Caj等[31]也以 CRISPR/Cas9 技术使黄瓜（Cucumis sativus L.）的eIF4E突变，再经由杂交而获得纯型合子且非基因编辑的T3世代eIF4E黄瓜突变株。病毒接种试验显示，eIF4E黄瓜突变株对黄瓜黄脉病毒（Cucumber vein yellowing virus）、矮南瓜黄化嵌纹病毒（Zucchini yellow mosaic virus）及木瓜轮点病毒-西瓜型（Papayar ingspot virus-watermelon strain）具有抗病性。

CRISPR/Cas9、ZFN与TALEN等技术的发展使编辑特定基因更为容易，已应用在农作物抗病、延长水果保质期、改变花卉色彩等农业性状的改良[32-34]。CRISPR/Cas9可以取代RNAi及基因编辑技術，默化特定基因，再通过孟德尔遗传，使得到的植株中Cas9和sgRNA等编辑基因，在子代与编辑后的基因分离，可视为非基因编辑植物。通过CRISPR/Cas9技术，可以同时编辑多个目标基因，而不改变作物原本的优良性状[35-37]。综合以上几种优势，CRISPR/Cas9将广泛应用于作物育种[4，38-39]。

3 农业基因编辑技术发展趋势

基因技术应用的目的是提高农作物生存率与生产率，农业基因技术在近几年获得了突飞猛进的发展，近几年极端气候、疾病和害虫的概率大大增加，与之相对的发展中国家面临人口增长而粮食和农业用地逐渐减少的现实。通过基因技术改善农作物的基因性状，促进品种迭代加速和适应环境能力的提升在目前农业经济学领域被广泛关注。

可以看出，基因编辑技术在植物作物中的应用逐渐增加，市场规模逐渐扩大。为了满足需求的增加，基因编辑技术在作物中应用的比重也在上升[26，40]（表3）。

为了更加详细了解基因编辑技术在农作物领域的应用，表4利用国际专利数据库-Derwent Innovation（DI）整理与汇总2007年1—12月这10年的发明专利情况，涵盖了35 491件发明（DWPI专利组），并以德温特世界专利索引（Derwent World Patent Index（DWPI）Manual Code）技术分类号进行技术趋势分析，探讨目前国际基因技术整体的趋势[41-42]。

在这些经济物种上的与之相对应的基因技术平台仍是以杂交（hybrid/cross breed）、人工授粉/精（artificial pollination/insemination）及遗传选型交配（genetic assertive mating/inbreeding）等传统育种方式的专利发明数据量最多，但育种技术在历经10年的遗传基因工程及分子生物技术的精进以及技术改良后，也逐渐发生变化，并且形成一定趋势。从技术发展多元化角度看，除了前期传统育种技术外，之后的基因定序技术、基因探勘技术使得近几年育种技术的发明更多元化[43]，其中包括植物农杆菌基因编辑技术、分子筛选/标志技术、核酸干扰或是沉默基因等技术的发展，都是从遗传性状改变或基因调控方面去作育种改良。从数据中发现近期（2014年后）在产业上被专家们认定是基因编辑（genome editing）技术的ZFN、TALENs、CRISPR/Cas的发明数量有明显增加的趋势，尤其是CRISPR技术平台在2016年的发明量达108件，也凸显了此技术平台在品种改良技术中的创造性（表5）。虽然巨核酸酶（mega nucleases，MGN）、寡核苷酸（oligo nucleotide）标靶突变及重组酶（recombinase）基因置入等技术平台在农业基因技术应用领域上有所增长，但是和已经逐渐成熟的技术平台相比还具有很大的上升空间。

就近期针对发明及运用基因编辑技术平台的专利权人来看，美国陶氏杜邦（Dow DuPont）的发明量高达67件，多数集中在运用ZFNs及CRISPR/Cas9技术;其次为先正达（Syngenta），发明数量44件，多运用在CRISPR/Cas9技术平台;而雷杰纳隆（Regeneron）药厂居第3位，有26件发明量。可以发现专注在此技术开发的专利权人大多为植物作物或是种子种苗的国际厂商。除此之外，中国农业科学院（CAAS China）也有22件的发明量，且以CRISPR/Cas9技术平台的发明最多。

在技术CRISPR/Cas9研发方面，美国保持着优势地位，我国科研机构在CRISPR/Cas9平台建设方面也取得了一定成绩（图2）。中国农业科学院联合国际水稻研究所完成了全球3 000份水稻DNA的重测序工作，为研究水稻靶向基因、指导水稻育种提供了重要技术支持[44]。

基因技术包括很多，按照产值可以分为DNA/RNA sequencing、Genotyping、 Marker-assisted、selection、Gene expression profiling、GMO/trait purity、DNA extraction/purification。由表2可见产值比例较高的集中在核酸的序列分析、遗传基因的分型及基因分子标识的筛选等技术项目，且各产值分别达 18.770亿、18.233亿及16.899亿美元（表5）。预计到2021年全球各基因技术的市场产值可达135.588亿美元，此产业市场的复合增长率（CAGR %）高达7.8 %。

近年来国际市场在面对因为极端气候逐渐增加的同时出现粮食安全危机的市场环境下，推动科技进步和技术更新，从市场规模的增长可以看出基因技术的重要程度。

从图2可以看出，基因技术的应用趋向于植物作物，并且多用于油料作物、谷类作物和豆类作物。其中水稻（rice）是重点基因编辑对象，说明为了应对全球粮食危机，应重点发展粮食作物的基因编辑技术。

4 小结与展望

为了应对未来粮食需求與极端气候，基因编辑技术应用于农业市场的主要目的是物种改良，使新品种产能提高、繁育率增加及储藏时间延长等，功能性地改善农作物的具体性状以提高产量。从近期专利发明的数量以及相关文献的分析整理方面可以看出国际种子种苗企业对于基因编辑技术平台的高度重视。CRISPR/Cas9、ZFN与TALEN等技术的发展使编辑特定基因更为容易，这些技术目前主要应用在农作物抗病、延长果园产品橱架寿命、改变花卉色彩等农业性状的改良方面。CRISPR/Cas9可以取代RNAi及转基因技术，默化特定基因，再通过孟德尔遗传，使得到的植株中Cas9和sgRNA等基因在子代与编辑后的基因分离，可视为非转基因植物。通过CRISPR/Cas9技术，基本可以同时编辑多个目标基因，而不改变作物原本的优良性状。综合以上几种优势，CRISPR/Cas9将广泛应用于作物育种。目前我国相关研究还比较薄弱，除了投入研究资源外，还应该积极地与其他具有基因编辑技术研发能力的小型生物实验室或研究单位共同合作，加速运用技术平台所开发的作物产品推广进程，增加市场粮食供应量。当然，技术与产品从开发到推广是个漫长的过程，在植物作物基因改变的情况下仍存在着诸多问题，但是科技发展刻不容缓，如何在环境风险与研发投入间取得效益的平衡也是将来需要克服的问题。

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