(宁夏大学农学院,宁夏银川 750021)

红枣富含多糖、酚类、环磷酸腺苷等生物活性成分,因其营养丰富,除鲜食外,现已被开发为枣汁、枣酒等多种产品,但加工产生的残渣大多被废弃处理,易造成资源浪费和环境污染。枣渣中含有大量色泽鲜艳的水溶性红色素,安全无毒[1],且有一定止泻、抗菌、抗癌、抗病毒等功能[2],是一种理想的天然色素资源。大量研究表明红枣色素具有较好的体外抗氧化活性,且多酚和黄酮可能是其发挥抗氧化作用的物质基础[3-4],对H2O2诱导血管内皮细胞氧化应激损伤[5]、常压缺氧、拘束应激性肝损伤[6]、KBrO3诱导氧化应激性肾损伤小鼠均有保护作用[7],属无毒级物质[8],因此,研究开发红枣色素是大势所趋。但天然色素极其不稳定,易受温度、光照、pH、金属离子等影响[9]。因从枣汁、枣酒废弃枣渣中提取的红色素加工处理方式不同,可能会导致抗氧化活性物质及抗氧化活性发生变化。枣汁果渣含有大量环核苷酸、黄酮类、五环三萜类化合物和多酚类等生理活性物质[10],资料表明,枣渣中红枣色素发挥抗氧化作用的主要物质是多酚和黄酮[4],在发酵过程中多酚和黄酮等活性物质会浸入酒中,且发酵使活性物质发生聚合、缩合、水解及氧化等化学反应,而导致活性物质含量发生变化[11]。曹延俊[12]研究表明,发酵导致石榴中鞣花单宁、花青素等抗氧化活性物质含量下降是由于酵母细胞释放自由基氧化所致。易桥宾等[13]研究显示发酵使可可豆中多酚类物质含量明显降低,抗氧化能力减弱。王大为等[14]比较了欧李果汁果渣与果酒果渣的基本成分,发现果酒果渣中多酚、原花青素和白藜芦醇等活性物质含量低于果汁果渣。

目前对于红枣果汁果渣色素的抗氧化活性已进行了较系统的研究,但对红枣果酒果渣色素的抗氧化活性,以及果汁果渣与果酒果渣色素抗氧化活性的比较研究未见报道,本实验以红枣果汁果渣、果酒果渣为原料,探究其色素抗氧化活性成分含量及抗氧化活性的差异,以期为开发天然抗氧化剂、提高红枣附加值、扩大枣渣利用途径提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红枣果汁果渣 宁夏灵武长枣榨汁后的副产物;红枣果酒果渣 宁夏灵武长枣发酵枣酒的副产物;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、芦丁标品、没食子酸标品、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS) 美国Sigma公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、邻苯三酚、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯醋酸 均为国产分析纯。

UV-2250型紫外可见分光光度仪 日本岛津公司;RE-52-05旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;DZF-6053 真空干燥箱 上海恒科学仪器有限公司;5417R台式离心机 德国Eppendorf公司;SHA-C水浴恒温振荡器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;101-3型电热鼓风恒温干燥箱 上海车星建材实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红枣色素的提取 红枣果汁果渣经发酵8 d后,残糖量不再发生变化,且无气泡产生,无明显发酵迹象,说明发酵结束,即得果酒果渣。将红枣果汁果渣、果酒果渣分别用清水清洗3次,烘干、粉碎,过40目筛。分别取一定量红枣果汁果渣粉和发酵2、4、6、8 d的果酒果渣粉,以料液比1∶20 (g/mL)加入0.4 mol/L NaOH液于75 ℃提取2 h,过滤、3000 r/min离心5 min、浓缩、真空冷冻干燥制得色素[15]。

1.2.2 总多酚含量的测定 采用Aspe[16]Folin-Ciocalteu法,没食子酸为标准品,绘得标准曲线为y=0.0012x+0.0007,R2=0.9996。分别取2 μg/mL红枣果汁果渣色素和发酵不同天数(同1.2.1)的果酒果渣色素溶液0.5 mL,分别加5.0 mL水,混匀,加1.5 mL福林酚试剂,混匀,室温放置6 min,加3.0 mL 10%碳酸钠溶液,用水稀释至25 mL,30 ℃水浴加热30 min后,取出,摇匀,试剂空白为参比,在765 nm处测定吸光度,结合标准曲线计算样品中的多酚含量。

式(1)

式中:c1为样品多酚浓度(mg/mL);V为样品液体积(mL);W为样品质量(g)。

1.2.3 总黄酮含量的测定 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法[17],芦丁为标准品,绘得标准曲线为y=0.0123x+0.0018,R2=0.9993。分别取2 mg/mL红枣果汁果渣色素和发酵不同天数果渣色素液各300 μL和5% NaNO2溶液90 μL,加至装有1.5 mL去离子水的离心管中,振荡混匀,静置6 min,加10% AlCl3·6H2O溶液180 μL,振荡混匀,待反应5 min后再加入1 mol/L NaOH溶液0.6 mL,加水稀释至3.00 mL,测定510 nm处吸光度值,根据标准曲线计算样品中总黄酮含量。

式(2)

式中:c2为样品总黄酮浓度(mg/mL);V为样品液体积(mL);W为样品质量(g)。

1.2.4 DPPH·清除率的测定 分别取1.0 mg/mL果汁果渣色素和发酵不同天数果渣色素液4 mL,加0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL,摇匀,25 ℃水浴20 min,在517 nm波长处测定吸光度,实验三次取平均值,计算清除率[3]。

式(3)

式中:Ai为色素液与DPPH乙醇溶液混合后的吸光度;Aj为色素液与体积分数95%乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液混合后的吸光度;A0为蒸馏水代替样液做空白对照测定的吸光度。

1.2.5 ABTS+·清除率的测定 参照文献[18],配制 ABTS工作液备用。分别取1.5 mg/mL果汁果渣和发酵不同天数果渣色素液0.1 mL,加3.9 mL ABTS溶液,混匀,室温下反应6 min,734 nm处测定吸光度,实验三次取平均值,计算清除率。

式(4)

式中:Ai为色素液与ABTS自由基工作液混合后的吸光度;A0为0.1 mL蒸馏水代替样液作空白对照测定的吸光度。

1.2.6 ·OH清除率的测定 参照文献[19],分别取1.0 mg/mL发酵不同天数果酒果渣和果汁果渣色素液1 mL,加6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液3 mL,3 mmol/L FeSO4溶液3 mL和9 mmol/L H2O2溶液3 mL,摇匀后于510 nm处测定吸光度,实验三次取平均值,计算清除率。

式(5)

式中:Ai为样液反应后测定的吸光度;Aj为3 mL蒸馏水代替硫酸亚铁溶液测定的吸光度;A0为蒸馏水代替样液做空白对照测定的吸光度。

式(6)

式中:Ai为样液反应后测定的吸光度;Aj为蒸馏水代替邻苯三酚溶液测定的吸光度;A0为蒸馏水代替样液做空白对照测定的吸光度。

1.2.8 还原能力测定 参考文献[18],分别取2.0 mg/mL发酵不同天数果酒果渣和果汁果渣色素液0.5 mL,加入0.2 mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.6)和1%铁氰化钾溶液各2.5 mL,混匀,50 ℃水浴20 min,加10%三氯醋酸溶液2.5 mL,离心(3000 r/min,10 min),取上清液2.5 mL,加蒸馏水2.5 mL和0.1% FeCl3溶液1 mL,混匀后静置10 min,在700 nm处测吸光度,实验三次取平均值,由吸光度的大小来判断还原能力的强弱。

1.3 数据处理

所有实验进行3次重复测定,测定结果以平均数±标准差表示,采用SPSS 18.0进行差异分析,以P<0.05判断为差异显著,相关性分析采用相关系数法,并用Microsoft Excel软件作图。

2 结果与讨论

2.1 红枣果汁果渣与果酒果渣色素的活性成分含量

红枣色素中抗氧化活性成分含量结果显示(图1),果汁果渣色素中总多酚、总黄酮含量均较高,分别为(11.293±0.739)和(3.059±0.044) mg/100 g,且果汁果渣色素中抗氧化活性成分含量显著高于8 d发酵结束的果酒果渣色素(P<0.05);果酒果渣色素中活性成分含量随发酵时间延长而明显降低(图2),其总多酚含量变化范围为5.481～11.293 mg/100 g,总黄酮含量变化范围为0.742～3.059 mg/100 g。多酚是存在于植物体内的具有多个羟基的酚类成分,黄酮类化合物是指2个具有酚羟基的苯环相互连接并具有多羟基、双键、芳香环等结构的一类化合物[21]。杨艳艳等[22]在枣醋发酵时发现,与枣汁相比,枣醋中多酚类、黄酮类物质含量明显下降。酵母菌在发酵中会产生如丙酮酸、乙醛等代谢产物,与果渣中多酚类物质反应生成一些大分子物质[23]。另外,在果胶酶和微生物的作用下,随发酵时间延长,酒精含量逐渐升高,果渣中活性成分被浸出[24],从而使果酒果渣中活性成分含量明显低于果汁果渣。

图1 红枣果渣色素的活性成分含量Fig.1 The active components contents of pigment from jujube pomace注:不同小写字母表示在P<0.05 水平差异显著,图2～图12同。

图2 发酵对红枣果渣色素活性成分含量的影响Fig.2 The effect of the fermentation on the content of the active components of pigment from jujube pomace注:0 d代表未经过发酵的果汁果渣色素,8 d代表发酵结束的果酒果渣色素;图4、图6、图8、图10、图12同。

2.2 红枣果汁果渣与果酒果渣色素清除DPPH·能力

DPPH·是一种稳定的以氮为中心的有机自由基,能够被具有抗氧能力的物质清除[25]。红枣果汁果渣与果酒果渣色素均具有较好的清除DPPH·能力(图3),且果汁果渣色素清除DPPH·能力显著强于果酒果渣色素(P<0.05);但果渣发酵6 d后,色素清除DPPH·能力降低速率减缓(图4)。发酵过程中,黄酮类物质因其酚羟基和羰基发生氧化、聚合而导致含量减少[13]。研究发现[3],总多酚、总黄酮与红枣色素抗氧化活性有较强的相关性,发酵使红枣果渣色素抗氧化活性降低可能是由于果渣中活性成分浸入到酒中,使活性成分含量下降所致。

图3 红枣果渣色素清除DPPH·的能力Fig.3 The DPPH· scavenging ability of pigment from jujube pomace

图 4 发酵对红枣果渣色素清除DPPH·能力的影响Fig.4 The effect of the fermentation on the DPPH· scavenging ability of pigment from jujube pomace

2.3 红枣果汁果渣与果酒果渣色素清除ABTS+·能力

ABTS法是一种被广泛用于测定总抗氧化能力的方法[26],红枣果汁果渣与果酒果渣色素均具有一定的清除ABTS+·能力(图5),且果汁果渣色素清除ABTS+·能力显著强于果酒果渣色素(P<0.05);随发酵时间延长,果渣色素清除ABTS+·能力逐渐降低(图6),发酵4 d后,清除能力降速减缓,并趋于稳定。发酵后果渣色素清除ABTS+·能力降低可能是因酵母菌活动与抗氧化活性成分生成大分子物质及酒精含量逐渐升高有关[23]。

图5 红枣果渣色素清除ABTS+·的能力Fig.5 The ABTS+· scavenging ability of pigment from jujube pomace

图 6 发酵对红枣果渣色素清除ABTS+·能力的影响Fig.6 The effect of the fermentation on the ABTS+· scavenging ability of pigment from jujube pomace

2.4 红枣果汁果渣与果酒果渣色素清除·OH能力

羟自由基(·OH)是生物体内最活泼且最具进攻性的活性氧自由基[27],因此·OH的检测对评价清除自由基活性物质的活性作用研究具有重要意义。红枣果汁果渣与果酒果渣色素清除·OH能力均较弱(图7),但果汁果渣色素的清除能力显著高于果酒果渣色素(P<0.05);发酵能明显降低果渣色素清除·OH能力(图8),发酵8 d的果渣色素清除·OH能力较未发酵的果汁果渣色素降低了10.32%。果渣经发酵处理后,色素清除·OH能力降低,可能是发酵促使枣渣中活性成分溶出,微生物破坏了枣渣中黄酮类和多酚类物质所致。

图7 红枣果渣色素清除·OH的能力Fig.7 The ·OH scavenging ability of pigment from jujube pomace

图 8 发酵对红枣果渣色素清除·OH能力的影响Fig.8 The effect of the fermentation on the ·OH scavenging ability of pigment from jujube pomace

2.5 红枣果汁果渣与果酒果渣色素清除能力

图9 红枣果渣色素清除的能力 Fig.9 The scavenging ability of pigment from jujube pomace

图 10 发酵对红枣果渣色素清除能力的影响Fig.10 The effect of the fermentation on the scavenging ability of pigment from jujube pomace

2.6 红枣果汁果渣与果酒果渣色素的还原力

抗氧化剂通过自身的还原作用,给出电子而使自由基变为稳定的分子,其本身失去活性[27],还原力与抗氧化活性呈明显的量效关系,供电子能力越强,吸光值越大,还原力越强,即抗氧化活性越强[30]。红枣果汁果渣与果酒果渣色素的还原力结果显示(图11),果汁果渣色素的还原力显著高于果酒果渣(P<0.05)。发酵能降低红枣果渣色素的还原力(图12),但变化不甚明显。抗氧化活性成分通过提供电子而使自由基被还原,起到抗氧化作用[31]。经过试验表明发酵会影响红枣果渣色素的还原力,但影响相对较小。

表1 红枣果汁果渣色素抗氧化活性物质含量与抗氧化活性的相关性Table 1 Correlation between antioxidant components and antioxidant activity of pigment from jujube juice pomace

注:*,显著相关(P<0.05);**,极显著相关(P<0.01),表2同。

表2 红枣果酒果渣色素抗氧化活性物质含量与抗氧化活性的相关性Table 2 Correlation between antioxidant components and antioxidant activity of pigment from jujube wine pomace

图11 红枣果渣色素的还原力Fig.11 The reducing power of pigment from jujube pomace

图12 发酵对红枣果渣色素的还原力的影响Fig.12 The effect of the fermentation on the reducing power of pigment from jujube pomace

2.7 抗氧化活性成分含量与抗氧化活性的相关性分析

3 结论

本实验探究了红枣果汁果渣与果酒果渣色素活性成分及抗氧化活性的差异,结果显示红枣果汁果渣色素抗氧化活性成分含量、抗氧化活性均显著高于8 d发酵结束的果酒果渣色素(P<0.05),随发酵时间延长,果渣色素抗氧化活性成分含量、抗氧化活性均明显降低,说明发酵可使果渣色素抗氧化活性成分含量降低、抗氧化活性减弱,但果汁果渣色素抗氧化活性成分含量与抗氧化活性相关性较强,而果酒果渣色素总黄酮含量与抗氧化活性相关性相对较弱。综上所述,红枣果汁果渣或者发酵初期果酒果渣含有较多抗氧化活性成分,具有较高的抗氧化活性,可为开发天然抗氧化剂、提高红枣附加值、开发功能性保健产品提供一定的理论参考。