李 杨 刘 曌 胡 淼 谢凤英,2 王 婵 齐宝坤

(1.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；2.哈尔滨市食品产业研究院，哈尔滨 150028)

0 引言

皮克林乳液是指由固态颗粒或固态胶体颗粒稳定的乳液[1]。前期主要研究利用无机粒子(例如二氧化硅等)稳定的皮克林乳液[2]，随着乳液在食品行业的发展，食品级颗粒越来越受到研究者的重视。目前，常用的食品级颗粒主要有纤维素、淀粉和几丁质[3-5]。几丁质作为一种线性多糖，含量丰富，来源广，成本低[6-7]。但天然几丁质分子量大，不溶于水、稀酸、碱及有机溶剂，因此需要对其进行改性。研究发现，改性几丁质比改性淀粉及纤维素具有更高的吸附活力，当颗粒不可逆地吸附在油-水界面时，液滴之间的空间位阻效应阻碍了液滴的聚集，使其稳定的皮克林乳液具有对聚结和奥氏熟化的优异稳定性[1-2]。pH值与温度对皮克林乳液的影响已经有相关研究[8]，而几丁质纳米晶体的结晶度与乳液稳定性之间的关系尚不明确。

本文通过酸解改性几丁质，探究酸解后得到的几丁质纳米晶体结晶度对乳液稳定性的影响。利用低温扫描电子显微镜观察乳液形貌，用接触角分析仪测量乳液的界面接触角，并从热稳定性和物理稳定性、乳析稳定性以及储藏稳定性4方面研究几丁质纳米晶体对皮克林乳液稳定性的影响。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

几丁质(Chitin)，上海源叶有限公司；葵花籽油，北京金世仓粮油贸易有限公司；透析袋(12～14 kDa)，北京索莱宝科技有限公司；盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，北京新光化工试剂厂；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Mastersizer 2000型粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；GL-21M型高速冷冻离心机，上海市离心机械研究所；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；UTL2000型乳化机，德国 IKA仪器设备公司；冻干机，上海汇分电子科技有限公司；pHSJ-4A型实验室pH计，上海雷磁公司；Nicolet 6700型傅里叶红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；锐影X射线衍射系统，荷兰帕纳科公司；OCA20型视频接触角测量仪，德国DATA PHYSICS仪器股份有限公司；低温扫描电子显微镜，日立高新技术公司。

1.3 方法

1.3.1几丁质纳米晶体制备

用3 mol/L HCl水解几丁质，水解时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，水解后去除无规则晶体得悬浮液，将悬浮液用4℃蒸馏水稀释10倍，停止水解反应，6 000g离心15 min，重复水洗两次离心除去多余的酸。析出物经透析膜(12～14 kDa)冲洗透析至pH值恒定(4 d)。然后，将悬浮液超声处理(300 W，10 min，超声10 s，间隔2 s)，得到分散均匀的几丁质纳米晶体(Chitin nanocrystals, ChN)悬浮液。采用冷冻干燥法制备不同结晶度的ChN粉末。

1.3.2X射线衍射测定

使用X射线衍射(X-ray diffraction, XRD)系统测定样品的X射线衍射图谱来确定不同酸解时间下纳米晶体的结晶度。其中CuKα辐射参数设置如下：波长0.154 1 nm，电压40 kV，灯丝电流30 mA，扫描速率为1(°)/min，2θ(衍射角)范围是5°～60°。结晶度(Crystallinity index value, CrI)计算公式为

(1)

式中I110——在2θ=19°时衍射的最大强度

Iam——非结晶部分(2θ=12.6°)的强度

1.3.3傅里叶红外光谱测定

通过傅里叶红外光谱(Fourier infrared spectroscopy, FTIR)仪测定不同酸处理时间对几丁质颗粒官能团的影响。傅里叶红外光谱仪参数设置：分辨率为4 cm-1，扫描波长范围为400～4 000 cm-1，扫描频率32次/s。取2 mg待测样品与溴化钾按质量比1∶100混合后压片，测定ChN的红外光谱。

1.3.4O/W型皮克林乳液制备

将不同结晶度的ChN粉末加入到pH值为3的去离子水中配制成1%的悬浊液，之后加入葵花籽油(体积分数10%)，在10 000 r/min下连续均质2 min，然后在400 W下冰水浴超声处理15 min(超声10 s，间隔2 s)制备成最终的O/W型皮克林乳液。

1.3.5低温扫描电子显微镜观察

参照文献[9-10]的方法通过低温扫描电子显微镜(Cryo-SEM)对乳液的界面结构进行观察。将所制备的乳液分别放入铜样品托上并浸泡于液氮中快速冷冻。在真空条件下，将样品转移到安装在扫描电镜样品舱端口上的制样舱中冷台上，进行冷冻断裂，在-95℃冷冻升华15 min并进行溅射镀膜处理。最后，将样品在真空条件下转移至样品舱中的冷台上在-130℃下进行超微结构观察。

1.3.6界面接触角测定

使用接触角分析仪测定水对乳液的界面接触角。将乳液涂于载玻片晾干，使其形成厚度为2 mm的薄膜。使用高精度注射器将一滴水(5 μL)滴入薄膜表面，立即用摄像机记录液滴图像。对液滴轮廓线用Laplace-Young方程拟合进行数值求解，每个样品作3次平行，每一个平行样品选取3处测量3个接触角，并对每个颗粒进行3次测量[4]。

1.3.7热稳定性测定

参照文献[11-12]的离心分离法测定皮克林乳液的热稳定性。将制成的乳液于80℃水浴下30 min并立即放入冰水浴中保存15 min，用直尺准确测量乳液的总高度，最后在25℃下1 300g离心5 min，用直尺测量乳液离心后上层乳剂的高度。乳液的热稳定性(Emulsion thermal stability, ETS)指数计算公式为

(2)

式中HInt——离心前乳液的初始高度

HCen——离心后上层乳剂的高度

1.3.8物理稳定性测定

采用离心分离法[11-12]测定。将新制备的乳液放入离心管中，直尺测量乳液初始高度，25℃下2 500g离心5 min，用直尺测量乳液离心后上层乳剂的高度。乳液物理稳定性(Emulsion physical stability,EPS)指数计算公式同ETS指数。

1.3.9乳析稳定性测定

图1 不同酸解时间下ChN的X-射线衍射图及结晶度

参照文献[13]的方法测定。将制备好的乳液分别置于10 mL的具塞比色管中，加入少量叠氮化钠以防止微生物生长，用玻璃塞密封并在25℃下放置7 d，每天用直尺对乳清层进行精确测量并记录。乳析稳定性通常采用乳析指数(Creaming index,CI)表示，计算公式为

(3)

式中HS——乳清层的高度，cm

HT——比色管中乳液的总高度，cm

1.3.10储藏稳定性测定

将O/W乳液常温储藏30 d测定其储藏稳定性。乳液的平均粒径通过使用Mastersizer 2000型粒度仪测量得到。将0 d和30 d的皮克林乳液用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH值为7)稀释1 000倍进行测量并分析比较。参数设置如下：颗粒折射率为1.560，连续相折射率为1.330，吸收参数为0.010。测定温度为25℃，平衡时间为120 s。并对0 d和30 d的乳液进行拍摄对比。

1.4 数据分析

所有实验进行3次重复测定，结果用平均值±标准差表示，所有实验采用Duncan’s单因素方差分析，采用SPSS 20.0软件对所测定的数据进行差异显著性分析，用Origin 8.5软件绘制趋势曲线图。

2 结果与分析

2.1 ChN结晶度

XRD是通过对材料进行X射线衍射分析其衍射图谱，可表征材料的结构或形态。文献[14]表明ChN在2θ=9.4°，12.7°，19.3°，23.1°，26.6°处有衍射峰。由图1a可知，ChN在经过1.0 h(2θ=9.2°,12.8°,19.3°,23.4°,26.5°)、1.5 h(2θ=9.3°,12.5°,19.1°,23.1°,26.2°)、2.0 h(2θ=9.4°,12.7°,19.2°,23.2°,26.3°)、2.5 h(2θ=9.3°,12.7°,19.2°,23.3°,26.4°)、3.0 h(2θ=9.2°,12.5°,19.2°,23.1°,26.3°)酸解处理后，也在相应的位置观察到衍射峰，说明这是ChN的典型特征峰。经计算得到5个酸解时间的ChN结晶度，如图1c所示。结果表明在2.5 h内结晶度随酸解时间的增加而增加，而过度的酸解会导致ChN的结晶度下降。因此，2.5 h的酸解时间得到的ChN结晶度最高，为78.15%，说明原料经过2.5 h的酸解后其中的无定形部分最大程度地被破坏；而之后随着酸解时间的增长，结晶度下降，可能是因为过度酸处理在破坏了无定形部分后继续破坏了有序结构，这与文献[5]的研究相似，但与其结果相比，本实验中ChN的结晶度略低，原因归结于原料及处理环境的不同。

2.2 傅里叶红外光谱

图3 不同结晶度ChN稳定的皮克林乳液低温扫描电子显微镜图

2.3 低温扫描电镜图像

低温扫描电镜是观察乳液界面结构最有利技术之一,可以观察到平均粒径小于100 nm的颗粒界面处填充结构，这使它能够在乳液界面上原位表征纳米级颗粒[1]。从图3可以看出，未经酸解的几丁质不能形成纳米晶体，且聚集在一起，无法对乳液进行包裹，不能形成多糖皮克林乳液典型的网状结构。而经过酸解之后形成的ChN不同程度地附着在乳液表面，形成了典型的网状结构，说明几丁质必须改性破坏其无定形区域才能附着于乳液表面，形成稳定乳液。如图3所示，酸解1.5、2.0、2.5 h的ChN大量附着在乳液表面，充分包裹液滴，与不存在界面稳定剂的体系相比，颗粒的存在可以增强聚结[21]。比较发现高结晶度的ChN颗粒更小，液滴表面附着更多，乳液的网状结构更明显，这可能是结晶度越高，在高压均质处理时，巨大的压降使得液体颗粒从喷嘴喷出瞬间高度破碎，被分散成更小的颗粒[22]，进而更多地包裹在乳液表面(图3)，使其具有更高的稳定性。

2.4 界面接触角

界面接触角指在气、液、固三相交点处所作的气-液界面的切线，是表征颗粒乳化剂吸附行为的一个重要参数，与液-固交界线之间的夹角为α，用来表示润湿程度[8]。α<90°表示固体表面为亲水性，其值越小，则润湿性越好；α>90°表示固体表面是疏水性[23]。图4显示了不同结晶度ChN制备的乳液接触角，由图4可知，乳液均为亲水性，但亲水程度不同。原始几丁质稳定的乳液(图4a)α最大，为71.1°，表明制备的乳液亲水性最差。经过酸解后几丁质稳定的乳液接触角变小，说明乳液的亲水性增加，并且可以看出，结晶度最高的ChN稳定的乳液(图4e)测得接触角最小，为36.6°，减小了一半左右，说明乳液的亲水性大大提高，原因可能是结晶度高的ChN经过均质及超声处理后具有更高的比表面积，能更多地吸附于乳液界面，使乳液与水之间有更多的接触[24]，形成更小的接触角，从而说明乳液表面附着更多纳米颗粒，稳定性更好。

图4 不同结晶度ChN稳定的皮克林乳液界面接触角

2.5 O/W型皮克林乳液的热稳定性及物理稳定性

采用离心分离法测定皮克林乳液的抗应力稳定性。由图5(图中同一参数的不同字母表示差异显著，P<0.05)可知，结晶度低的ChN稳定的皮克林乳液的热稳定性较低，这与文献[12]研究相似；而结晶度最高的ChN制备的乳液热稳定性指数最高，为63%；酸解1.0、1.5、2.0 h制备的ChN稳定的O/W乳液具有相近的物理稳定性，而酸解2.5 h制备的ChN稳定的O/W乳液物理稳定性指数最高，为69.52%。综上，结晶度高的ChN稳定的乳液热稳定性及物理稳定性高，可能是因为结晶度高的ChN粒径更小，具有更大的比表面积，亲水性更高，能更充分紧密地吸附在界面上，使乳液不易被破坏[25]。

图5 不同结晶度ChN稳定的皮克林乳液ETS指数和EPS指数

2.6 乳析稳定性

图6 不同结晶度ChN稳定的皮克林乳液乳层析指数

图6为皮克林乳液贮藏7 d的乳析指数CI变化。如图所示，未经酸解的ChN形成的皮克林乳液乳析指数最大，说明乳液分层最明显，乳析稳定性最差。而经过酸水解ChN制备的皮克林乳液CI显著低于未经酸解的ChN制备的乳液(P<0.05)，并且乳液在贮藏4 d之后CI几乎保持不变。结果显示酸解2.0 h和2.5 h形成的纳米晶体制备的乳液CI最低，不足1%，说明这两种乳液的乳析稳定性最好。文献[26]测定了大豆分离蛋白与壳聚糖复合物稳定的乳液乳析指数，最低为45.8%，而本研究乳液的乳析指数大大减小，可能是因为当颗粒达到一定的结晶度，具有了更小的界面接触角，一旦它们附着到油-水界面，就被有效且不可逆地吸附[27]。冷冻扫描电镜图像也观察到颗粒不同程度地吸附在液滴表面，且结晶度高的纳米晶体能更多地附着在表面以更好地稳定乳液，使乳液具有更高的乳析稳定性。

图7 不同结晶度ChN稳定的皮克林乳液平均粒径

2.7 储藏稳定性

通过粒度仪测定了乳液制备0 d和常温储藏30 d的平均粒径，如图7(图中同一储藏时间不同字母表示差异显著，P<0.05)所示。ChN稳定的皮克林乳液0 d时平均粒径高达16 μm，而经过酸水解的ChN稳定的皮克林乳液平均粒径不足5 μm，粒径明显减小；文献[28]的研究表明，酸解1.5 h获得的ChN制备的质量分数为0.05%的乳液平均粒径最小约10 μm，而本实验酸解2.5 h获得的结晶度最高的ChN稳定的乳液粒径小于5 μm，粒径减小近1/2，可能是因为高结晶度的纳米晶体中无定形区域被更大地破坏，在高剪切、空穴爆炸、超声破碎等力学作用下，形成更小更分散的纳米晶体[22]，使得制备的乳液粒径也更小。此外，30 d后的平均粒径变化明显，未经酸解的几丁质稳定的乳液粒径显著减小，仅纳米级，从图8g可以看出，原始几丁质形成的乳液中间部分已经呈透明状，下层出现絮状沉淀，这已经不再是常规意义上的乳液，因此导致测定的粒径变化极大；而ChN稳定的皮克林乳液经过30 d的常温储藏，仅上层不同程度地出现分层，下层并未发生絮凝，但是平均粒径也有增加，说明乳液的稳定性随时间的延长会发生改变。由图7可以看到，结晶度最高的ChN制备的乳液0 d和30 d的平均粒径最小，且分层最不明显，说明随时间的增加，结晶度越高的几丁质纳米晶体稳定的皮克林乳液储藏稳定性越好。最重要的是，所有ChN稳定的乳液在经过30 d的常温储藏后均未出现透明部分，且没有絮状沉淀，这在常规表面活性剂稳定的乳液中是不常见的[29]，可能是吸附在油-水界面的颗粒可以在空间上阻碍液滴的紧密接近，从而减小聚结程度[27]。由此可得，酸解之后的几丁质极大地提高了乳液的储藏稳定性。

图8 皮克林乳液储藏图像

3 结束语

酸解时间会影响ChN的结晶度，在2.5 h内ChN的结晶度随时间的延长而增加，过度酸解会破坏结晶区，导致结晶度下降；高结晶度的ChN颗粒小、亲水性好，能更充分地包裹于乳液表面，使乳液抗应力热稳定性、物理稳定性、乳析稳定性提高；常温储藏30 d后，ChN稳定的乳液不会出现絮状沉淀，且分层不明显，具有良好的储藏稳定性。由此可得，酸解改性后结晶度越高的几丁质纳米晶体制备的皮克林乳液越稳定。