呙 月,刘诗月,黄玉琴,胡 波

(湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院肿瘤科,襄阳 441000;*通讯作者,E-mail:hb20054291@126.com)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,全球乳腺癌发病率逐年上升,严重威胁女性健康和生命[1]。乳腺癌的治疗方法主要包括手术切除、放化疗、内分泌治疗等,尽管多数乳腺癌患者的治疗效果较好,但仍有部分患者的预后并不理想[2]。目前,寻找具有抗癌效果的非编码RNA已成为乳腺癌分子靶向治疗研发的重点。微小RNA(microRNA,miRNA)是非编码RNA家族的重要组成[3]。miRNA主要通过与靶基因信使RNA(mRNA)3′非翻译区结合,抑制靶基因mRNA的翻译或促进靶基因mRNA降解,从而负向调控靶基因的表达[4]。miRNA参与人类各种疾病包括肿瘤的发生、发展[5]。有研究证实,miR-4500在甲状腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌等多种肿瘤进程中具有类似“抑癌基因”的作用[6-8]。然而,miR-4500在乳腺癌中的表达模式及在乳腺癌中是否发挥“抑癌基因”功能尚未清楚。本研究旨在探讨miR-4500在乳腺癌细胞系中的表达模式及对乳腺癌细胞发展和转移的影响,并探讨其分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

RPMI1640培养液、DMEM/F12培养液和小牛血清购于美国Hyclone公司;Transwell小室购自美国Millipore公司;人乳腺癌细胞株MB-MDA-468、MCF7、SKBR3、HCC1937和人永生化正常乳腺上皮细胞MCF-10A购于美国模式培养物集存库(ATCC);双荧光素酶报告实验试剂盒购自美国Promega公司;聚合酶链反应(real-time PCR)试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司;Lipofectamine3000购于美国Invitrogen公司;野生型LIN28B基因3′端非翻译区荧光素酶质粒和其突变型质粒由美国Promega公司合成;miR-4500 mimic、miR-NC由上海吉凯生物工程有限公司合成;抗体(β-Tubulin、LIN28B、β-catenin、c-myc、Cyclin D1、VEGF)购于美国CST公司;MTT试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 细胞培养与转染

MB-MDA-468、MCF-10A用加入10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养,MCF7、SKBR3、HCC1937用加入10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养,在37 ℃、5%CO2环境下培养。选对数生长期的HCC1937细胞为转染对象,转染操作严格根据Lipofectamine3000说明书进行。分别转染miR-4500模拟物和miR-NC至乳腺癌细胞HCC1937,命名为miR-4500组和miR-NC组。

1.3 实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测miR-4500和LIN28B的表达

采用Trizol法提取乳腺癌细胞总RNA,逆转录为cDNA后按照real-time PCR试剂盒说明书操作。GAPDH和核内小RNA U6分别为LIN28B和miR-4500的内参。数据采用2-ΔΔCt法计算。引物设计如下。miR-4500上游引物:5′-GGGGTGAGGTAGTAG-3′,下游引物:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。LIN28B上游引物:5′-TTGAGTCAATACGGGTAACAGGA-3′,下游引物:5′-TGACAGTAATGGCACTTCTTTGG-3′。β-Tubulin上游引物:5′-TGGTGGACTTAGAGCCAGG-3′,下游引物:5′-CCCTTTCGCCCAGTTGTTC-3′。

1.4 Transwell迁移实验检测细胞迁移能力

将转染后的HCC1937细胞用无血清培养液密度调整为3×106个/ml,小室上室注入细胞2×104个,小室下室注入500 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,放置于培养箱中培养12 h。棉签轻轻擦去未穿过底膜的上室细胞,甲醇固定5 min,0.1%结晶紫染色5 min,流水清洗,在倒置显微镜下观察并拍照。实验重复3次。

1.5 MTT检测细胞增殖能力

将转染后的HCC1937细胞接种到96孔板,连续5 d进行MTT检测,每天1次。每天检测前,每孔加入50 μl MTT染料,37 ℃培养4 h。每孔加入150 μl二甲基亚砜,充分振荡。酶标仪检测每孔细胞在470 nm处的吸光度(A)值。实验重复3次。

1.6 生物信息学软件预测和双荧光素酶报告实验验证

利用生物信息学软件microT-CDS和miRecords预测,miR-4500的靶基因可能是LIN28B。将转染后的HCC1937细胞随机分为4组:野生型+miR-4500组(转入野生型质粒+miR-4500)、野生型+miR-NC组(转入野生型质粒+miR-NC)、突变型+miR-4500组(转入突变型质粒+miR-4500)、突变型+miR-NC组(转入突变型质粒+miR-NC)。应用双荧光素酶报告实验试剂盒进行检测,分析4组HCC1937细胞的萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性。实验重复3次。

1.7 Western blot检测LIN28B和Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达

将转染后的HCC1937细胞裂解并提取总蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,硝酸纤维素膜转膜后,封闭液封闭,使用一抗在4 ℃孵育过夜,使用二抗在室温下孵育2 h。使用ECL显影液滴加显影,采用凝胶成像系统观察、拍照。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 miR-4500在乳腺癌细胞系中的表达

real-time PCR显示,MCF-10A、MB-MDA-468、MCF7、SKBR3、HCC1937细胞中miR-4500表达量分别为1.00±0.05,0.29±0.02,0.54±0.05,0.72±0.07和0.13±0.03(见图1)。与永生化正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,乳腺癌细胞中miR-4500的表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。由于HCC1937细胞miR-4500表达降低最显著(P<0.01),因此选择HCC1937细胞进行研究。

与MCF-10A细胞相比,*P<0.05,**P<0.01图1 miR-4500在乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中的表达Figure 1 The expression of miR-4500 in breast cancer cells and normal breast epithelial cells

2.2 real-time PCR检测转染后miR-4500的表达

real-time PCR的结果表明,miR-4500组乳腺癌HCC1937细胞中miR-4500的表达水平(11.60±1.08)显著高于miR-NC组(1.22±0.48),两组间差异有统计学意义(P<0.01),证明外源性miR-4500在HCC1937细胞中成功表达。

2.3 miR-4500对乳腺癌HCC1937细胞迁移的影响

由图2可见,miR-4500组穿透滤膜的细胞数(53.29±11.27)显著少于转染miR-NC组穿透滤膜的细胞数(106.50±13.70),两组间差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验的结果显示过表达miR-4500能够抑制乳腺癌细胞HCC1937的迁移。

与miR-NC组相比,*P<0.05图2 转染miR-4500对乳腺癌HCC1937细胞迁移的影响Figure 2 Effect of miR-4500 on breast cancer HCC1937 cell migration

2.4 miR-4500对乳腺癌HCC1937细胞增殖的影响

为检测过表达miR-4500对HCC1937细胞增殖的影响,采用MTT法检测各组细胞增殖情况,结果显示,与miR-NC组相比,miR-4500组的HCC1937细胞增殖活力显著降低,在转染72 h后,两组比较差异有统计学意义(P<0.05,见图3)。

与miR-NC组相比,*P<0.05图3 转染miR-4500对乳腺癌HCC1937细胞增殖的影响Figure 3 Effect of miR-4500 on the proliferation of breast cancer HCC1937 cells

2.5 LIN28B基因3′非翻译区与miR-4500配对序列

利用生物信息学软件microT-CDS和miRecords预测,miR-4500的靶基因可能是LIN28B,miR-4500种子区存在与LIN28B基因3′非翻译区互补配对的序列(见图4)。

图4 miR-4500与LIN28B 3′UTR互补配对的序列Figure 4 Binding sequence of miR-4500 and LIN28B 3′UTR

2.6 荧光素酶活性检测结果

由图5可见,野生型+miR-4500组相对荧光素酶活性较野生型+miR-NC组显著降低(P<0.01),说明miR-4500能够有效抑制野生型质粒荧光素酶活性;突变型+miR-4500组相对荧光素酶活性较野生型+miR-4500组显著升高(P<0.01),说明miR-4500无法抑制突变型质粒荧光素酶活性。因此,只有miR-4500能够有效与野生型质粒3′-UTR区结合。

与野生型+miR-NC相比,**P<0.01图5 各组荧光素酶活性比较Figure 5 Comparison of luciferase activity among four groups

2.7 real-time PCR检测转染后LIN28B的表达

real-time PCR的结果表明,miR-4500组乳腺癌HCC1937细胞中LIN28B的表达水平(0.11±0.03)显著低于miR-NC组(1.06±0.21),两组间差异有统计学意义(P<0.01),证明miR-4500可下调HCC1937细胞中LIN28B的表达。

2.8 miR-4500对乳腺癌HCC1937细胞LIN28B及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响

Western blot结果显示,与miR-NC组相比,miR-4500组的LIN28B表达水平降低,Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、c-myc、Cyclin D1、VEGF蛋白表达水平降低(见图6)。

图6 转染miR-4500对乳腺癌HCC1937细胞中LIN28B及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响Figure 6 Effect of miR-4500 on the expression of LIN28B and Wnt/β-catenin signaling pathway proteins in breast cancer HCC1937 cells

3 讨论

对乳腺癌生长和转移相关分子机制的研究及寻找潜在治疗靶点是乳腺癌防治研究的重点[9]。miRNA是一种长度约为22个核苷酸的小分子非编码RNA,主要在转录后水平发挥调控基因的作用[10]。已有研究发现,多种miRNA如miR-124、miR-195、miR-497、miR-146a-5p、miR-200c在乳腺癌中异常表达,发挥类似“癌基因”或“抑癌基因”的作用,参与调控乳腺癌细胞增殖、分化、迁移及侵袭过程,与乳腺癌患者的预后密切相关[11-14]。现已证实,miR-4500在多种实体瘤中表达降低,具有类似“抑癌基因”的作用[7]。然而,miR-4500在乳腺癌细胞系中的表达模式和作用机制未见报道。本研究结果表明,与正常乳腺上皮细胞相比,miR-4500在乳腺癌细胞系中明显低表达。进一步研究表明,miR-4500过表达显著抑制HCC1937细胞的迁移及增殖,提示miR-4500可发挥类似“抑癌基因”的作用,抑制乳腺癌的生长和转移。

利用生物信息学软件microT-CDS和miRecords预测,miR-4500的靶基因可能是LIN-28同系物B(lin-28 homolog B,LIN28B),miR-4500种子区存在与LIN28B基因3′非翻译区互补配对的序列。LIN28B是一种高度保守的RNA结合蛋白,在胚胎干细胞和发育组织中高表达,在成熟组织中很少表达[15]。研究证实,LIN28B是一种癌基因,在多种恶性肿瘤如肺癌、结肠癌表达明显上调,参与肿瘤细胞的代谢调控,具有促进肿瘤细胞发展和转移的作用[16,17]。更有研究发现,LIN28B与肿瘤的恶性程度、耐药性和不良预后呈正相关,提示LIN28B在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用[18]。LIN28B在乳腺癌组织中表达上调,且与乳腺癌细胞的不良分化、分期分级、异常增殖显著相关[19]。本研究通过双荧光素酶报告实验证明,miR-4500可与LIN28B基因3′非翻译区互补配对。real-time PCR和Western blot显示,在乳腺癌细胞HCC1937中过表达miR-4500后,LIN28B基因表达降低,表明miR-4500可抑制LIN28B基因的表达。Wnt/β-catenin信号通路参与调控乳腺癌细胞的迁移和生长,被认为是乳腺癌发生的重要调控因子之一[20]。本研究中Western blot结果显示,乳腺癌细胞HCC1937中LIN28B基因表达降低后,Wnt/β-catenin信号通路蛋白如β-catenin、c-myc、Cyclin D1、VEGF表达降低,提示乳腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路被阻滞。

综上所述,miR-4500在乳腺癌细胞系中表达降低,miR-4500通过靶向调控LIN28B阻滞Wnt/β-catenin信号通路,抑制乳腺癌HCC1937细胞的迁移和增殖能力,表明在乳腺癌中miR-4500可作为抑癌基因发挥功能,为乳腺癌的治疗提供了新的思路。