陈 晓，戴建军，李 垚，吴彩凤，张树山，孙玲伟，张德福，李 丽

(1上海农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2上海农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海 201106；3锦州医科大学畜牧兽医学院，锦州 121001；4上海交通大学医学院，上海200025)

崇明白山羊被喻为“长江三角洲白山羊”，是崇明地方特有的优良品种。崇明白山羊体型中等偏小，白色被毛，体格健壮，具有适应力强、抗病力强、产肉性能高、繁殖性能高等优质品性[1]。目前崇明白山羊饲养总量达到50万头左右，上海市崇明地区已对崇明白山羊农产品实施地理标志性保护。作为全国重点保护和发展的家畜品种，其在形态学、生理生化方面研究较多，但基于分子水平的研究尚少。研究崇明白山羊群体的遗传多样性对于该品种资源的科学有效保护及实验动物化应用具有实际意义。

ISSR即简单重复序列间分子标记，是基于SSR基础之上迅速发展起来的，并广泛应用于动植物居群遗传学研究的一项新型DNA分子标记技术[2]。其原理是用锚定的微卫星DNA作为引物，并在SSR序列的3’或者5’端加入2—4个随机核苷酸，对两侧具有反向排列SSR的DNA片段进行PCR扩增。该技术具有操作简便、稳定性高、多态性丰富、试验成本低、信息量大、适用范围广等优点[3-4]。本研究旨在采用ISSR技术对崇明白山羊的遗传多样性与亲缘关系进行分析，并掌握崇明白山羊遗传多样性的现状，以期对其种质资源的合理保护和开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

样品采自上海市崇明地区崇明白山羊群体，由90只公羊和116只母羊组成，共计206只。每只山羊颈静脉采血约6 mL，存放在抗凝采血管中置于-20℃备用。采用全血基因组DNA提取试剂盒提取崇明白山羊的血液基因组DNA，经2%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计测定样品的质量和浓度，-20℃保存备用。

1.2 引物筛选

根据加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的第九套100条ISSR引物序列中筛选出12条引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1 ISSR引物序列

注：Y=(C,T)，R=(A,G)

1.3 PCR反应与条带记录

PCR总反应体系为25 μL，含模板DNA 10—20 ngμL，引物10 μmolL，氯化镁3 mmolL，dNTP 500 μmolL，0.1U Taq DNA聚合酶。其反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 60 s，49—63℃ 60 s，72℃ 90 s，40个循环；72℃ 7 min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离检测(1×TAE,120 V,1 h)，以Marker DL 2000作为分子质量标准，通过凝胶成像系统拍照观察。在电泳图谱中记录清晰可见的条带，每一条带记为一个位点，在指定迁移位置有条带出现时，被认为是相同的DNA片段产物，存在扩增条带则记为“1”，缺失条带则记为“0”，建立谱带“01”矩阵二元数据。

1.4 参数统计与处理

应用NTSYS和POPGEN软件来检测遗传多样性指标，分析亲缘关系。各群体内遗传参数包括：ISSR-PCR产物的总条带数、多态性条带数、多态位点百分率(PPB)、观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s遗传多样性指数(h)、Shannon’s多样性信息指数(I)、群体总基因多样性(Ht)、群体内基因多样性(Hs)、遗传分化值(Gst)及基因流(Nm)。

为评估崇明白山羊群体遗传关系，根据POPGENE计算得出遗传相似系数和遗传距离，使用NTSYS.pc 2.10e软件按照非加权组平均法(UPGMA)对崇明白山羊个体间构建聚类分析图谱。

2 结果与分析

2.1 崇明白山羊ISSR扩增结果

12条引物在206个样本中共产生181条符合数据统计的条带，平均每个引物扩增出15.08条，其中多态性条带163条，占总条带数的90.06%，部分扩增结果见图1。

2.2 崇明白山羊遗传多样性

将ISSR扩增的结果转化成0，1二元矩阵后，输入POPGENE统计软件，检测到90只崇明白山羊公羊个体、116只崇明白山羊母羊个体，共206只崇明白山羊的各项指标(表2)。结果显示，崇明白山羊群体具有较高的遗传多样性，其中公羊的各项遗传多样性水平均高于母羊。

表2 崇明白山羊群体的遗传多样性

组别群体总基因多样性(Ht)群体内基因多样性(Hs)遗传分化值(Gst)基因流(Nm)崇明白山羊0.279 7±0.034 00.226 7±0.025 80.189 42.139 7

2.3 崇明白山羊的聚类分析

将ISSR扩增结果转化成0，1二元矩阵后，输入NTSYS.pc2.10e软件中，得到206只崇明白山羊样本的相似性系数为0.519 3—0.989 0，遗传距离为0.147 4—0.863 0，其中204号、205号个体的遗传相似系数最高，达到了0.989 0，说明这两个个体的遗传相似度较高，即两者的亲缘性较近。使用UPGMA方法对崇明白山羊个体间进行聚类分析，生成聚类图谱(图2)，在遗传相似系数0.83处，可将206个群体划分11类，第一类包括10个个体(1—10号)，第二类包括1个个体(11号)，第三类包括50个个体(12—50号，52—62号)，第四类包括1个个体(51号)，第五类包括28个个体(63—90号)，第六类包括29个个体(91—96号，98—120号)，第七类包括13个个体(170—182号)，第八类包括22个个体(121—142号)，第九类包括27个个体(143—169号)，第十类包括24个个体(183—206号)，第十一类包括1个个体(97号)，且前五类均为公羊个体，后六类均为母羊个体。

3 讨论

物种遗传多样性的存在能够维持物种的生存和进化能力[5]，物种在历经漫长的时间选择和基因突变后，遗传多样性也会随之提高，物种遗传多样性既是评价生物进化水平的重要指标，也是维持生态系统稳定的基础[6]，多数物种的灭绝都是因为遗传多样性水平的降低所造成，所以保护物种的种质资源意义重大。近年来ISSR技术在遗传多样性及亲缘性问题的研究中已广泛得到应用[7-9]，此项技术作为物种基因组多态性的分析，避免了环境与地理位置的限定，其多态性较高，获得的信息量多于PAPD(随机扩增多态性DNA)分子标记技术，精确程度可与RFLP(限制性片段长度多态性)技术相比较[10-11]。本研究采用ISSR分子标记技术对崇明白山羊大量样本进行遗传分析探讨，以期更为准确的揭示崇明白山羊遗传多样性及亲缘关系。

本研究结果显示：公羊的各项遗传多样性水平要高于母羊，崇明白山羊整体遗传多样性丰富，其中PPB、Na、Ne、h、I值均高于郑佩培等[12]使用ISSR技术对崇明白山羊的分析。遗传分化值通常被用以衡量群体间的遗传分化程度，参照Buso等[13]的标准，当Gst为0.05—0.15定义为中等分化程度，本研究中崇明白山羊的Gst为0.189 4，说明其遗传分化程度较低，崇明白山羊的遗传变异有81.06%发生在种群内，而种群间的遗传变异仅有18.94%。基因流作为影响遗传结构的重要因素，与种群大小并无关系，当NM值≥1时便可以防止因遗传漂变引起的种群遗传分化[14]，本研究中崇明白山羊的NM为2.139 7，说明崇明白山羊群体间存在一定的基因流，但遗传漂变并不是影响崇明白山羊种群间分化的主要因素，遗传分化的主要原因是由于种群内部的遗传变异，崇明白山羊群体具有一定的适应能力。崇明白山羊虽然在地理分布条件上较为局限，但其遗传多样性水平依然稳定，但崇明白山羊的 Ne低于Na，表明在群体内存在较多低频率的等位基因，因此应对现有低频率基因实施有效保护，从而避免基因丢失现象的发生。

利用NTSYS.pc2.10e软件，得出崇明白山羊的相似性系数为0.519 3—0.989 0，高于西藏日土藏山羊遗传相似系数，后者为0.460 0—0.740 5[19]。崇明白山羊的遗传距离为0.147 4—0.863 0，根据遗传相似系数对崇明白山羊的个体聚类分析后，这206个个体可划分为11个群体，其中公羊的群体样本基本聚集一起，母羊的群体样本也基本聚集在一起，第一类与第二类为大种公羊聚为一支，第三类与第四类为成年公羊聚为一支，第五类为小公羊与成年公羊聚为一支，第六类与第七类为成年母羊聚为一支，第八类与第九类为成年母羊聚为一支，第十类为小母羊与成年母羊聚为一支，第十一类成年母羊与小母羊优先聚为一支。可以发现97号个体与其他成年母羊群体的个体间遗传距离较远，说明97号个体与其他母羊的群体个体可能源自不同的类群。

种群达到瓶颈期是物种遗传多样性水平降低的重要因素，一旦种群的数量减少就会导致遗传多样性的降低，那么物种就会存在濒临灭绝的风险。本研究主要应用ISSR分子标记对崇明白山羊进行了遗传多样性和遗传聚类的分析，初步得出了该物种的遗传多样性信息，研究结果有利于制定和实施有效保护崇明白山羊的遗传资源方案。