何成勇，张丽勍，高清华，段 可*

(1上海海洋大学食品学院，上海 201306；2上海市农业科学院林木果树研究所，上海市设施园艺技术重点实验室，上海 201403)

植物通过表面的跨膜识别受体识别病原物相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)产生的免疫称为病原物相关分子激发的免疫(PAMPs-triggered immunity，PTI)。病原物为了打破植物的PTI防御系统，逐渐进化出一种攻击武器—效应子[1]。效应子通常是由病原微生物如细菌、卵菌、真菌等分泌的小分子物质及次级代谢产物[2-5]。当效应子被病原物分泌至寄主细胞后，其中一部分停留在寄主细胞质外体，并在质外体发挥相应的作用，这类效应子被称为胞外效应子；另一部分能跨越寄主细胞膜进入细胞质内并与相应的胞内靶标互作，这类效应子被称为胞内效应子。大多数的效应子都属于胞内效应子，可以被富含亮氨酸的重复序列和核苷酸结合位点(Nucleotide binding site-leucine rich repeat，NBS-LRR)抗性蛋白受体所识别[6]。效应子依据其功能不同可以分为两类：一类是通过抑制寄主的抗性反应从而促进病原物的侵染，称为效应子诱发的感病性(Effector-triggered susceptibility，ETS)；另一类则能够直接或间接被寄主植物识别，导致寄主产生效应子触发的免疫反应(Effector-triggered immunity，ETI)[7]。真菌类生物或真菌本身可能有成百上千种分泌蛋白，但只要该蛋白可以进入寄主体内并通过影响寄主植物的生理反应或者干扰寄主植物的免疫防卫反应，即是效应子。因此，有无信号肽成为效应子评判的重要指标[8]。

草莓炭疽病(Strawberry anthracnose)是影响我国乃至全球草莓产业发展的重大病害，在草莓生长发育的各个阶段均可发病，危害草莓叶片、匍匐茎、根冠等部位，可造成严重的经济损失[9-10]。炭疽菌有多个小种，不同小种在草莓上的病症极为相似，但侵染位点和侵染力存在明显差异[11]。我国草莓炭疽病主要在南方长江中下游温暖湿润地区发生[12-14]，引起该病害的炭疽菌菌株主要是果生刺盘孢菌(Colletotrichumfructicola)，果生刺盘孢菌全基因组信息的公布[15]，极大地促进了果生刺盘孢菌-草莓的互作研究工作。

目前，国内对果生刺盘孢菌的研究主要集中于病原菌的鉴定及其生物特性分析，而针对果生刺盘孢菌效应子的研究鲜有报道。本研究利用生物信息学手段并结合转录组分析结果，预测果生刺盘孢菌效应子，并分析其功能，以期为进一步研究果生刺盘孢菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

‘久香’草莓，为上海市农业科学院林木果树研究所草莓课题组自主育成品种，种植于上海市农业科学院设施园艺技术重点实验室温室大棚。本氏烟种子、果生刺盘孢菌菌株、农杆菌GV3101菌株及大肠杆菌DH5α菌株为本实验室保存，瞬时表达载体PGD由中国农业科学院植物保护研究所张昊副研究员惠赠。

RNA提取试剂盒购于北京原平皓生物技术有限公司；pEASY-T1 Simple Cloning Vector载体、高保真DNA聚合酶购于北京全式金生物技术有限公司；T4 DNA连接酶购于Fermentas公司(加拿大)；质粒小量提取试剂盒、DNA纯化试剂盒购于Axygen公司(美国)；氨苄青霉素(Amp)、庆大霉素(Gen)、利福平(Rifampicin，Rif)、卡那霉素(Kan)购于上海生工生物有限公司；RT-PCR反转录试剂盒、DL2000 DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司；效应子扩增引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。

表1 候选效应子扩增引物

1.2 方法

1.2.1 候选效应子的生物信息学分析

1.2.2 候选效应子的转录分析

2017年1月将栽培草莓品种‘久香’组培苗移种人工气候室，6个月后，选取36株有8—10片复叶的健壮植株，每12株为1个重复，喷雾法接种C.fructicola分生孢子悬浮液。覆膜后移至光照培养箱，培养条件为：光培养暗培养时间为12 h12 h，光通量密度为125 μmol(m2·s)，相对湿度为70%，温度为25℃。于附着胞形成阶段(Planta appressoria，PA)、活体营养阶段(Biotrophic phase，BP)、死体营养阶段(Necrotrophic phase，NP)分别取样，提取叶片RNA，根据Takara反转录试剂盒说明书合成第一条cDNA链。PCR反应体系：cDNA 2 μL，10×buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmolL)2 μL，高保真Taq酶0.5 μL，上、下游引物(10 μmolL)各1 μL，ddH2O补至50 μL，充分混匀。PCR反应程序：94℃ 2 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，30次循环；72℃ 10 min；4℃保存。使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，纯化产物送铂尚生物技术(上海)有限公司测序鉴定。

1.2.3 候选效应子基因克隆

将测序验证的回收产物连接至克隆载体pEASY-T1 Simple Cloning Vector，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞后于37 ℃倒置避光培养12 h。挑取单克隆，测序验证阳性克隆。

1.2.4 农杆菌介导的烟草瞬时表达

将克隆得到的效应子基因构建至瞬时表达载体PGD，重组质粒由铂尚生物技术(上海)有限公司测序鉴定。重组质粒采用冻融法转化农杆菌GV3101感受态，涂板，挑取单克隆，PCR法检测阳性克隆。

重组载体、Bax、P19、空载的阳性单克隆于5 mL LB液体培养基中[Kan：50 μL+Rif：50 μL+(0.2 molL)MES：1 mL+(100 mgmL)AS：20 μL]、28℃、200 rmin、摇床培养24 h；离心富集菌体，加入2 mL悬浮液[50 mL ddH2O+(1 molL)MgCl2：500 μL+(100mmolL)As：100 μL+(0.2 molL，pH 5.7)MES：2.5 mL]，涡旋混匀。调节菌液OD600值：P19=0.2，空载=0.4，重组载体=0.4，Bax=0.4。空载、效应子、Bax分别与P19菌液1∶1混合，暗处理2 h。选取合适的烟草叶片注射混合菌液，4—5 d后观察效应子诱导或抑制细胞凋亡的反应，拍照并记录。

2 结果与分析

2.1 草莓果生刺盘孢菌候选效应子Pfam分析

草莓果生刺盘孢菌3个候选效应子蛋白中，候选蛋白CGGC5_4 515.1和CGGC5_7 542.1不具有典型的结构域，不属于任何一个蛋白家族。CGGC5_8 825.1第36—266位核苷酸具有过氧化物酶类家族结构域，属于过氧化物酶类家族(表2)。

表2 草莓果生刺盘孢菌候选效应子蛋白Pfam分析

注：E值<0.001，结果可靠

2.2 草莓果生刺盘孢菌候选效应子信号肽分析

由表3可知，3个候选效应子都具有信号肽。其中，CGGC5_4 515.1 N端第1—24位氨基酸为其信号肽所在位置，其余2个候选效应子的N端第1—18位氨基酸为其信号肽所在位置。

表3 草莓果生刺盘孢菌候选效应子蛋白信号肽分析

注：+表示具有信号肽，1—18或1—24表示该信号肽为效应子第1—18或1—24位氨基酸，2425和1819表示该效应子第25位氨基酸和第19位氨基酸之前为信号肽序列

2.3 草莓果生刺盘孢菌候选效应子亚细胞定位分析

由表4可知，3个候选效应子蛋白通过分泌途径分泌至胞外的得分值均≥0.400，且定位预测可信度较高(RC=1)，结果较为可靠。因此，初步认为3个候选效应子蛋白均为分泌蛋白，可通过草莓果生刺盘孢菌分泌途径分泌至胞外。

表4 草莓果生刺盘孢菌候选效应子亚细胞定位分析

注：mTP：线粒体定位；SP：分泌蛋白，有信号肽；Other：定位于其他细胞结构；Loc：预测定位结果；S：分泌途径。RC：可信度等级为1—5，RC值越低，定位越准确

2.4 草莓果生刺盘孢菌候选效应子跨膜结构域预测

3个候选效应子蛋白均不含有跨膜结构域，表明这3个候选效应子均属于分泌蛋白。

2.5 草莓果生刺盘孢菌候选效应子系统进化树构建

由图1可知，C.orbiulare，C.fioriniae，C.nymphaeae，C.salicis，C.tofieldiae，C.incanum，C.higginsianum，C.sublineola和C.graminicola为同一分支；C.fructicola单独成一分支。C.tofieldiae，C.incanum，C.higginsianum，C.sublineola和C.graminicola同源性较高；C.fioriniae，C.nymphaeae，C.salicis同源性较高，而C.orbiulare则与分支一种其他菌株同源性较低，被独立分到另一小分支。

2.6 草莓果生刺盘孢菌候选效应子转录组学分析

转录组测序结果表明，尽管这3个候选效应子在果生刺盘孢菌侵染的不同阶段均上调表达，但表达程度有较大差异(图2)，说明这些蛋白可能在果生刺盘孢菌侵染过程中发挥不同的作用。RT-PCR结果表明，3个候选效应子在侵染的3个阶段均有表达，预测这3个候选效应子均为果生刺盘孢菌效应子。

2.7 农杆菌介导的烟草瞬时表达

由图3可知，CGGC5_4515、CGGC5_7542、CGGC5_8825分别与Bax共同注射烟草时均能抑制由Bax基因诱导的烟草细胞的凋亡。

3 结论与讨论

尽管活体营养和死体营养型真菌调控寄主植物细胞的机制已较清楚，但半活体营养型真菌对植物的调控机制尚不明确[16]。活体营养型真菌为了与植物建立紧密的联系，通过吸器或菌丝从植物中吸取营养[17]，死体营养型真菌则分泌一些特殊的酶或者毒性因子将寄主植物细胞杀死，并从死亡的植物中吸取营养[18]，半活体营养型真菌则具有活体营养型和死体营养型真菌调控机制的双重特征。研究表明：植物病原真菌能够在侵染过程中分泌效应子。这些效应子在病原真菌致病的过程中与寄主植物互作并发挥重要作用[19]。效应子通常具有疏水的N末端信号肽，这主要是由于效应子多数是经内质网或高尔基体分泌[20]。随着高通量测序技术的出现，效应子已逐渐成为抗性基因筛选和新品种辅助选育的工具，效应子组学极大的促进了传统的抗性育种，成为一种更高效的育种方法。本研究利用生物信息学手段并结合转录分析结果，对初步获得的3个果生刺盘孢菌候选基因进行蛋白家族和跨膜结构域预测、信号肽分析和亚细胞定位分析，结果表明，3个候选基因均为果生刺盘孢菌的效应子。

HR反应是植物对入侵病原物产生的一种快速、激烈的应答反应，常常伴随着病原物入侵位点细胞的死亡[21]。Carney等[22]通过叶片接种青枯菌，认为不亲和的菌株在接种后24—30 h可在植物上激发明显的HR反应。Nahar等[23]研究发现效应蛋白RipAX1能够在茄子叶片上诱导特异性的HR反应。赵郭珍[24]利用农杆菌介导的瞬时表达系统在本氏烟及7种烟草上鉴定发现,效应子Rip5可在所有的测试植物上诱导叶片组织的HR反应。本研究中的3个候选效应子均能抑制Bax诱导的细胞凋亡。该类效应子可能在果生刺盘孢菌入侵草莓的活体营养阶段发挥作用，通过抑制草莓植株产生的HR反应，从而逃避寄主对果生刺盘孢菌的抑制，达到成功侵染的目的。