丁献华，陈 伟，张直峰

(1临汾职业技术学院经济管理系，临汾041000；2山西师范大学生命科学学院，临汾041000)

花是被子植物独特的繁殖器官，在已研究的被子植物中超过90%的物种具有典型的完全花结构[1]，即由4轮器官构成，从外到内依次是萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊。花器官早期发育ABC模型是近30年来植物发育生物学最重要的突破之一，通过不同同源异型家族基因互作可以很好地解释花器官发育特性。具体而言，A类基因调控萼片发育；A类+B类基因协作控制花瓣发育；B类+C类基因协作调控雄蕊发育；C类基因控制雌蕊发育[2]。随着后来在矮牵牛分离胚珠发育所需的D类基因及拟南芥中分离花瓣、雄蕊和心皮发育所需的E类基因的发现，ABC模型被修正为至今广泛认可的ABCDE模型。在这些基因中，除了A族基因APETALA2(AP2)属于AP2ERE基因家族以外[3]，其余基因均属于MADS-box转录因子基因家族[4]。在B族基因中，最经典的包括拟南芥(Arabidopsisthaliana)APETALA3(AP3)和PISTILLATA(PI)基因，以及金鱼草(Antirrhinummajus)DEFICIENS(DEF)和GLOBOSA(GLO)基因，均参与花瓣和雄蕊的器官发育过程[4]。有研究从基部被子植物中克隆和鉴定出与拟南芥同源的A、B、C和E基因，其表达模式基本符合ABCDE模型，但B、C类同源基因表达区域有所外延[5-7]。荷花作为基部被子植物，品种繁多，花器官变异丰富，荷花B类基因如何表达及是否参与花瓣状器官分化正引发研究者的兴趣。目前，有关荷花花发育相关研究多集中在栽培方式、生理生化、组织细胞学、甲基化等方面[8-14]，花发育相关基因(尤其B类基因)功能研究的报道较少。荷花基因组测序已完成[15-16]，大量基因组和转录组[17-18]数据的释放为功能基因的研究提供了很好的平台。

本研究采用同源基因克隆技术分离荷花(NelumbonuciferaGaertn.)B类AP3DEF-like MADS-box功能基因，并利用生物信息学分析基因及编码蛋白质的结构特征，实时荧光定量分析基因在不同组织器官中的时空表达模式，探讨NnDEF基因在荷花花器官发育及花型形成机制中的作用，以期为今后利用基因工程技术改变荷花花型特征奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以临汾职业技术学院南湖实训基地荷花重瓣品种‘重瓣一丈青’(Nelumbonucifera‘chongban yizhangqing’)为材料，于2016年5—6月份取长度约4cm的花苞用于克隆目标基因。为了进一步进行实时定量PCR表达分析，同时采集单瓣品种‘一丈青’(Nelumbonucifera‘yizhangqing’)和重瓣品种‘重瓣一丈青’(Nelumbonucifera‘chongban yizhangqing’)花苞长度为4cm时的根、茎、叶、块茎、萼片、外侧花瓣、内侧花瓣、雄蕊和心皮组织。所有样本采集后液氮速冻，于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.2 总RNA提取及反转录

采用CTAB法提取‘重瓣一丈青’花苞总RNA，使用DNase I(TaKaRa)去除混杂DNA。提取RNA样品，使用Nanodrop2000c微量紫外分光光度计进行纯度和含量测定。使用RevertAidTM first-Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，China)合成cDNA第一链，操作按照试剂盒说明书进行。

1.3 基因克隆与序列分析

查找NCBI中EST序列信息,设计NnDEF1和NnDEF2基因引物序列NnDS1FR和NnDS2FR(表1)，以荷花花苞cDNA为模板进行基因全长PCR扩增。反应体系为25 μL，反应条件：95℃ 5 min；95℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的片段，连接pGEM-T载体测序，引物合成和测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 荷花NnDEF1和NnDEF2基因克隆及表达分析所用引物

使用DNAMAN软件进行序列拼接、核酸及编码氨基酸预测等分析，获得的基因序列在NCBI(http：www.ncbi.nlm.nih.gov)网站上进行Blastx比对；使用MEGA 5.0和Clustalx 1.83软件进行系统进化树构建。

1.4 基因表达分析

分别提取‘一丈青’和‘重瓣一丈青’的根、茎、叶、块茎、萼片、外侧花瓣、内侧花瓣、雄蕊和心皮组织总RNA，反转录获得cDNA(方法同1.2)，使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TaKaRa)和ABI 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems，America)进行Real-time qPCR分析。NnDEF1和NnDEF2基因特异引物序列NnDQ1FR、NnDQ2FR和内参基因Actin基因引物见表1。反应程序为：95℃预变性10 min；95℃ 20 s，68℃ 20 s；40个循环。每个样品取样设置3个生物学重复，对每个基因分析进行3次技术重复，采用2-ΔΔCt法进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 基因克隆与氨基酸序列分析

以‘重瓣一丈青’花苞cDNA为模板，分别利用特异引物进行PCR扩增，分离获得约700 bp的扩增产物，将其连接pGEM-T载体后，进行大肠杆菌转化，每个基因挑取2个阳性克隆进行测序，获得2个基因全长cDNA序列。Blastx比对分析表明：所获片段与植物B功能基因家族AP3DEF亚家族有较高的同源性，证明为所要目的片段，分别命名为NnDEF1和NnDEF2。使用DNAMAN软件进行序列拼接及分析发现，NnDEF1基因CDS序列全长678 bp，推测编码225个氨基酸(图1a)；NnDEF2基因CDS序列全长693 bp，推测编码230个氨基酸(图1b)。两个基因蛋白结构域分析表明：NnDEF1蛋白包含57个MADS-结构域、28个I-结构域、68个K-结构域和72个C-结构域；NnDEF2蛋白包含57个MADS-结构域、28个I-结构域、69个K-结构域和76个C-结构域(图1)。此外，单、重瓣品种来源的基因编码区无序列差异。

氨基酸同源序列比对结果表明，NnDEF1和NnDEF2基因编码的氨基酸序列与其他B类家族AP3DEF亚家族基因编码的氨基酸序列具有较高的同源性(图2)。以往研究指出，B类家族功能基因每个进化系均编码其代表的氨基酸基序。NnDEF1和NnDEF2基因编码的氨基酸序列C-末端均包含典型的PI衍生基序(FAFHLQPNQLNLQ和FAFHLQSNHPNNLL)和PaleoAP3基序(YGSYDLRLA和YGSHSLRHLS)(图2)，表明所获NnDEF1和NnDEF2基因属于B类PaleoAP3型基因。

基于GenBank数据库获得44个B类家族MADS-box基因，用于系统进化树的构建，以确定荷花NnDEF1和NnDEF2基因的发育位置(图3)。最大似然法ML(Maximum likelihood)构建系统进化树结果显示，PIGLO和AP3DEF同源基因在系统树中被明显划分，NnDEF1和NnDEF2归于AP3DEF同源基因单元组，与双子叶植物纲木兰目馨香木兰MaodAP3(Magnoliaodoratissima)、山玉兰MadeAP3(Magnoliadelavayi)、毛茛目三叶木通AktAP3(Akebiarifoliate)、领木春EupAP3(Eupteleapleiosperma)、耧斗菜AqvuAP3-3(Aquilegiavulgaris)、樟目蜡梅ChprAP3(Chimonanthuspraecox)和胡椒目金栗兰ChspAP3(Chloranthusspicatus)等聚为小支；同时与单子叶植物纲禾本目水稻OsMADS16(Oryzasativa)、微子目香荚兰VaplDEF(Vanillaplanifolia)、百合目龙舌兰AgteMADS6(Agavetequilana)等聚为大支，属于PaleoAP3进化系。

基因序列比对发现，NnDEF1和NnDEF2基因之间CDS区同源性为78.79%，远高于其他同源基因；氨基酸序列系统进化分析发现，与其他物种的同源蛋白相比，2个基因编码的蛋白间同样具有最高同源性(68.15%)和进化相似性，结合二者基因CDS序列高度同源性，推测NnDEF1和NnDEF2基因可能属于直源基因(图3)。

2.2 基因表达模式分析

利用Real-time qPCR对NnDEF1和NnDEF2基因在两种瓣型材料不同组织中的表达进行分析，结果显示：NnDEF1和NnDEF2基因主要表达在花瓣和雄蕊组织中(图4)。在单瓣型材料中，NnDEF1基因在雄蕊和内侧花瓣组织中高表达，且雄蕊中表达量最高；NnDEF2基因在外侧花瓣、内侧花瓣和茎组织中高表达，以外侧花瓣最高，内侧花瓣次之。在重瓣型材料中，NnDEF1基因在雄蕊和内侧花瓣组织中高表达，且两种组织中的表达量相当；NnDEF2基因在外侧花瓣、内侧花瓣和茎组织中高表达，以外侧花瓣最高，内侧花瓣与茎组织表达量相当(图4)。

3 讨论

B类MADS-box功能基因在花发育过程中的功能和作用已在多种植物中详尽报道[19-26]，而其在荷花中的基因特征还不甚了解。荷花属于莲科莲属多年生水生花卉，具有优良的观赏、食用和药用价值。荷花花瓣形态变异丰富，基于花瓣数量可分为单瓣型、半重瓣、重瓣、重台和千瓣型[27]。荷花原始瓣型为单瓣型，通过雄蕊、 雌蕊的瓣化依次演化出不同重瓣花型。在经典的ABC模型中，B类MADS-box功能基因的主要功能是调控花瓣和雄蕊发育的关键调节因子[20，23-24，28]。因此，研究花瓣、雄蕊发育调控基因，对探讨荷花花发育及分析荷花瓣化现象的分子机制具有重要意义。

本研究通过RT-PCR技术成功获得荷花B类MADS-box同源基因NnDEF1和NnDEF2，序列同源性及系统进化树分析表明，NnDEF1和NnDEF2基因编码的氨基酸与其他植物的AP3DEF-like基因编码的氨基酸具有较高的同源性，C-末端包含保守的PI-衍生基序和paleoAP3基序，属于AP3DEF亚家族paleoAP3进化系，与馨香木兰MaodAP3、山玉兰MadeAP3、三叶木通AktAP3、领木春EupAP3、蜡梅ChprAP3和金栗兰ChspAP3等聚为一类，这些均属于基部双子叶植物。该结果与APG III系统相一致，说明AP3DEF-like基因在进化上相对保守，同时也例证了荷花归属于基部被子植物[29]。

关键调控基因的复增及其功能趋异是形态多样性和进化的重要途径[30-31]。NnDEF1和NnDEF2基因CDS序列同源性(78.8%)和氨基酸同源性(68.2%)均远高于其他物种同源基因，表明二者可能属于直源基因。这种同源基因CDS序列同源性高于氨基酸序列同源性的现象，也是基因加倍后趋异进化的常见现象。这些结果表明，荷花AP3DEF-like基因可能存在基因加倍现象，而这种基因加倍后趋异进化现象则可能是荷花出现复杂花型变异的原因。

基因表达分析表明，NnDEF1和NnDEF2基因的表达既具有品种间的相似性,也具有同一个体内的差异性。在两种花型荷花材料中，NnDEF1基因倾向于在花瓣和雄蕊组织中表达，这与经典的ABC模型中B类基因表达模式相符合[32-34]；而NnDEF2基因表达更广泛，除了在茎、花瓣和雄蕊组织中高表达外，在根、叶、萼片、心皮中均有表达，推测是由于B类基因复增后产生与其表达模式相一致的新功能，如兰花AP3DEF直系同源基因OMADS3影响分生组织发育[31]及大丁草(Gerberaanandria)GDEF1和GDEF2基因对叶、苞叶、花茎、花及根等器官发育的影响[25，35]。此外，本研究发现,NnDEF1基因的表达部位更靠近花器官内侧，包括内侧花瓣和雄蕊组织；而NnDEF2基因的表达则更靠近外侧组织，包括外侧花瓣和内侧花瓣组织。这种表达趋势表明NnDEF1和NnDEF2基因在调控荷花花瓣发育过程中存在功能异化，相对而言NnDEF1基因在调控内侧花瓣和雄蕊发育中的作用较大，而NnDEF2基因则主要调控外侧组织。比较单瓣型和重瓣型荷花材料可以发现，二者的基因表达模式差异主要为NnDEF1基因。单瓣型材料中NnDEF1基因在雄蕊组织中的表达量明显高于内侧花瓣，而在重瓣型材料两个组织中的表达量相当。这表明在常规单瓣型材料中主要在雄蕊中表达的NnDEF1基因在重瓣型材料内侧花瓣组织出现提高表达，这与已知的荷花重瓣花的形成途径主要是雄蕊瓣化的结论相一致。这些结果表明，NnDEF1基因在荷花瓣化发育过程中可能发挥重要作用，其调控方式需要进一步深入研究。