王国平，鲍志娟，许鹏

(1.浙江大洋生物科技集团股份有限公司，浙江 杭州 311616； 2.浙江大洋科技钾盐企业研究院，浙江 杭州 311616)

恩拉霉素(enramycin)，又名持久霉素，是由放线菌发酵而得，包括13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成的有机碱，可作用于细菌的裂殖阶段，抑制细菌细胞壁合成。恩拉霉素对肠内有害梭状芽孢杆菌抑制力很强、长期使用后无抗药性，通过改变肠道内的细菌群，促进动物对饲料中营养成分的利用效果，提高猪、鸡增重和饲料转化率，且不会通过肠道吸收，对农作物、鱼类和环境无毒无害，是目前最为安全、有效的动物专用抗生素。

核辐射具有穿透能力强、不升高产品温度、适合包装密封物品、不耐热物品等优点，灭菌效果安全可靠，常用于中西药制剂和食品灭菌[1-5]。美国等国家已批准核辐射技术用于饲料及饲料原料防霉，并在农牧水产饲料生产部门进行推广应用，中国也有针对辐射对饲料影响的研究报道[6]。本试验通过比较不同辐射剂量对恩拉霉素灭菌效果及稳定性的影响，旨在探究辐射灭菌对恩拉霉素的作用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

8%恩拉霉素预混剂由浙江大洋生物科技集团股份有限公司生产，采用聚丙烯内袋和编织外袋包装，每袋25 kg。恩拉霉素对照品，含量98.1%，由美国BOC SCIENCES公司提供，批号B13Z0912。

营养琼脂培养基(蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4)，高盐察氏培养基(硝酸钠2 g，磷酸二氢钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，氯化钠60 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL)，伊红美蓝琼脂(蛋白胨10 g，乳糖10 g，磷酸二氢钾2 g，伊红0.4 g，美蓝0.065 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.9～7.3)，北京三药科技开发公司提供。

甲醇、乙腈，均为色谱纯，购自美国天地有限公司；丙酮、盐酸、磷酸、磷酸二氢钠、重铬酸钾，均为国产分析纯，由南京化学试剂厂提供。

1.1.2 仪器及设备

Waters高效液相色谱仪(1525二元高压梯度泵、2487紫外双波长检测器，Sunfire C18分析柱，Breeze工作站)，高速台式离心机(Sigma 1-15K)，超净工作台(HZC-1209C，上海智城)，全温摇床(HZD-50R，江苏华利达)，高压灭菌锅(LEDX-40BⅠ)，pH测定仪(METTLER TOLEDO 320)，电子天平(BS2233)，紫外分光光度计(岛津UV-1800)，剂量计，钴-60(60Co，浙江辐照中心提供，源强4.8万Ci)。

1.2 辐射灭菌剂量确定

设空白对照组和12个不同剂量级别的辐射组，每组3袋样品。所用样品均为同批次生产，分装于100 g规格的铝箔袋中，并热熔封口。样品置于台板上，距离辐射源100 cm，辐射组分别以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 kGy吸收剂量照射(以实际测量值为准)。

辐射后的样品保存于室温，对照组不作灭菌处理。然后按照中国药典(2015版)、GB/T 13092—2006《饲料中霉菌总数测定》、GB/T 13093—2006《饲料中细菌总数的测定》方法，检测样品中的霉菌、细菌和大肠埃希菌数，微生物培养为阴性的辐射剂量为有效灭菌剂量。

1.3 高效液相色谱法测定恩拉霉素降解率

1.3.1 标准溶液的配制

精密称取恩拉霉素对照品，置于50 mL容量瓶中，用提取液(丙酮∶1 mol·L-1盐酸∶水为350∶120∶560，V/V)溶解，定容至刻度，振摇使均匀，制备20 mg·mL-1浓度标准品储备液。吸取标准品储备液用pH 4.5磷酸二氢钾缓冲液稀释成约2 mg·mL-1浓度标准品工作液，用0.22 μm有机滤膜过滤后备用。

1.3.2 样品溶液的配制

精密称定不同辐射剂量处理后的样品1.0 g置50 mL容量瓶中，加入提取液约40 mL，超声40 min，静置冷却至室温后，用提取液定容至刻度，混匀后3 500 r·min-1离心5～10 min，取上清液于样品瓶中备用。吸取清液用pH 4.5磷酸二氢钾缓冲液稀释成约2 mg·mL-1浓度，用0.22 μm有机滤膜过滤后待测。

1.3.3 高效液相色谱条件

流动相：乙腈∶0.05 mol·L-1磷酸二氢钠溶液(30∶70，V/V)；柱温35 ℃；检测波长230 nm；进样量20 μL；流速1.0 mL·min-1。

1.3.4 进样测试

在上述液相色谱条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标准品工作液，直至相邻2针的相对响应变化值小于1.0%，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。供试品色谱峰的保留时间应与标准品的色谱峰的保留时间一致。

1.4 最佳辐射剂量的放大验证

根据小试样品的辐射剂量、灭菌效果及恩拉霉素的降解情况，优选出最佳剂量。在此辐射剂量下，将6个批次的恩拉霉素产品进行辐射，每组6个样品，贮存于室温库房中，湿度40%～70%，分别于辐射后0、30、60、120、180、360 d取样测试微生物指标。

2 结果与分析

2.1 60Co不同辐射剂量下的灭菌效果

如表1所示，随着60Co辐射灭菌剂量的增加，灭菌效果随之提高。辐射剂量达到3 kGy时，霉菌、细菌和大肠埃希菌均已全部灭杀(图1)。

表1 不同辐射剂量辐射后恩拉霉素预混剂中微生物指标

2.2 60Co不同辐射剂量下恩拉霉素的降解率

如表2所示，60Co辐射会导致恩拉霉素降解，随着辐射剂量的增加，降解率随之增长。辐射剂量低于3 kGy时，恩拉霉素降解率低于2%；辐射剂量超过8 kGy时，降解率明显提高。

2.3 60Co最佳辐射剂量下产品的贮存期

根据以上的研究结果，考虑到大规模的辐射与小样的差异性，将恩拉霉素产品的辐射剂量定为4 kGy。

如表3所示，在4 kGy辐射剂量下，3个批次的恩拉霉素辐射后贮存于室温库房中，保存0、30、60、120、180、360 d后的微生物指标均符合相关限量要求，说明采用60Co辐射灭菌方式可行，辐射后贮存期可超过1年。

A～D—分别为辐射前、辐射剂量1、2、3 kGy处理后样品的细菌培养情况；E～H—分别为辐射前、辐射剂量1、2、3 kGy处理后样品的霉菌培养情况。图1 辐射前后恩拉霉素微生物培养情况

表2 不同辐射剂量下恩拉霉素降解情况

表3 4 kGy辐射剂量辐射后恩拉霉素预混剂相关指标

3 小结

恩拉霉素预混剂采用60Co辐射灭菌方式可行，灭菌效果稳定可靠，且不会影响恩拉霉素的贮存稳定性，可延长产品的保质期。辐射剂量对于灭菌效果和恩拉霉素降解率呈正相关性，4 kGy辐射剂量下，可将细菌和霉素全部杀灭，恩拉霉素降解率小于2%。