朱金峰 陈冲 陈启龙

摘 要：采用平板分离技术，从中烟100烟草品种的根际土壤中分离获得1株细菌，将该菌株编号为ZJFLH3。采用钼蓝比色法测定出ZJFLH3菌株經过62h发酵培养后上清液中的游离态磷含量明显增加，浓度达到了128.3μg/mL，据此将ZJFLH3菌株初步定性为解磷活性功能菌株。经过对ZJFLH3菌株的生长条件初步测定，结果表明：ZJFLH3菌株的适宜生长的温度范围是25～35℃，最适温度为30℃;适宜的pH值范围是6～7，最适酸碱度环境为中性偏酸;适宜生长的盐浓度范围是0.15%～0.2%，高盐不适宜菌株生长。ZJFLH3菌株可用作烟草菌肥、制剂开发的备用土著菌株。

关键词：烟草;分离;解磷菌;生长特性

中图分类号 S-3文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）04-0024-03

Abstract： A bacterial strain was isolated from rhizosphere soil of Chinese tobacco 100 by plate separation technique， and the strain was numbered as ZJFLH3. Molybdenum blue colorimetry was used to determine the content of free phosphorus in the supernatant of ZJFLH3 strain after 62 h fermentation culture，and the concentration reached 128.3 g/mL. Based on this， ZJFLH3 strain was preliminarily characterized as a functional strain with antiphosphorous activity. Furthermore， the growth characteristics of ZJFLH3 strain were preliminarily determined. The results showed that the suitable temperature range of ZJFLH3 strain was 25～35℃， and the optimum temperature was 30℃. The optimum pH range is 6～7，and the optimum pH environment is neutral acid. The range of salt concentration suitable for growth is 0.15%～0.2% and High salt is not suitable for strain growth. ZJFLH3 strain can be used as an alternative indigenous strain for tobacco fertilizer and preparation development.

Key words： Tobacco; Isolation; Dephosphorization bacteria; Growth characteristics

磷是作物正常生长发育所必需的矿质元素之一，是植物体内核酸、多种酶类、三磷酸腺苷等的重要组成部分。作物缺磷时，常表现为生长缓慢、分枝少、矮小瘦弱;叶片易脱落，色泽呈暗绿或灰绿色，并常出现紫红色;植物根系发育受阻，成熟推迟，产量和品质均显著降低[1-3]。土壤中含有大量的磷元素，但磷多以有机和无机的高分子化合态存在，植物并不能直接吸收利用。我国约有74%的耕地天然缺磷，在作物发育周期中及时足量补充磷肥尤为重要[4，5]。在磷肥的开发和应用实践中，除了传统化学磷肥的广泛使用之外，生物磷肥逐渐得到重视和应用，其理论基础是土壤中的磷素循环以微生物活动为中心，微生物的活动对土壤磷的转化和有效性影响很大[2，5]。研究表明[6-8]，土壤中存在大量的具有解磷功能的微生物，其可以将植物难以吸收利用的难溶性磷转化为可吸收利用的可溶性磷。因此，开展解磷菌的筛选、鉴定、活性评估及功能菌株的生长特性研究，对开发生物磷肥具有重要意义。本研究以烟草根际土壤为材料，对解磷菌进行了筛选、活性测定及生物学特性研究等，以期丰富生物磷肥开发的野生土著微生物资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料 土壤样品采自漯河市烟草公司烟草生产田，烟草品种是中烟100。解磷菌平板分离培养基：葡萄糖5g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.5g，氯化钾0.3g，七水硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，四水硫酸锰0.03g，磷酸钙8g，琼脂粉20g，pH7.0。发酵培养基：葡萄糖5g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.5g，氯化钾0.3g，七水硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，四水硫酸锰0.03g，磷酸钙8g，pH7.0。活化培养基：胰蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，pH7.2。基础培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH7.2。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株筛选 称取中烟100烟草根际土样5g，加入已灭菌的盛有45mL无菌水的三角瓶中。震荡混匀30min，然后静置30s，此混悬液认定为10-1浓度的土壤稀释母液。再按10倍梯度稀释法在无菌操作条件下依次稀释至10-6浓度。试验分别选取10-4、10-5和10-6 3个梯度稀释液，并分别吸取0.1mL涂布于解磷菌平板分离培养基，于28℃恒温培养4 d。选取生长良好、特征典型、解磷圈明显的单菌落进行连续3次的划线纯化，获得目标菌株。

1.2.2 目标菌株解磷活性的定量测定 将分离获得的具有解磷活性菌株采用钼蓝比色法测定解磷能力，操作步骤参考文献进行[9]。

1.2.3 影响目标菌株生长的因素 温度：首先将目标菌株在活化培养基中活化（菌悬液OD600=0.2），以0.1%的接种量接入基础培养基中，并分別在15、20、25、30、35、40和45℃温度梯度下，180r/min震荡培养12h，分光光度计测定600nm处的OD值。3次重复取平均值，下同。pH：首先将目标菌株在活化培养基中活化（菌悬液OD600=0.2），以0.1%的接种量接入调配好pH值的基础培养基中，培养基的pH值分别为3、4、5、6、7、8、9和10，180r/min条件下震荡培养12h，分光光度计测定600nm处的OD值。NaCl：首先将目标菌株在活化培养基中活化（菌悬液OD600=0.2），以0.1%的接种量接入调配好NaCl含量的基础培养基中，NaCl含量（W/V）分别为0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、1%、2%、3%和4%，180r/min条件下震荡培养12h，分光光度计测定600nm处的OD值。

2 结果与分析

2.1 获得菌株 试验通过解磷菌平板分离培养，获得3株具有明显解磷圈的菌株，其中解磷圈最大的菌株单菌落呈淡黄色，菌落较大，边缘整齐，在培养基表面微凸，半湿润（图1），初步定性为具有解磷活性的目标菌株，并将其编号为ZJFLH3。

2.2 ZJFLH3的解磷活性 采用钼蓝比色法，对分离获得的菌株ZJFLH3的解磷活性进行定量测定，结果表明，目标菌株ZJFLH3经过连续74h发酵，发酵液培养基上清液中游离态磷含量存在动态变化，发酵的前50h，游离态磷含量随时间延长而不断增大，发酵50h时达到最大值141.6μg/mL;发酵50h以后，游离态磷含量略有下降。而空白对照始终都未检测到游离态磷含量的变化，进一步说明目标菌株ZJFLH3具有解磷功能（图2）。

2.3 影响ZJFLH3的生长因素

2.3.1 温度 由图3可知，菌株ZJFLH3在20℃以下时OD值较小，说明菌株生长较为缓慢，高于20℃时，OD值增长幅度迅速增大，至30℃时到达最大值;30℃以上温度条件下OD值开始变小，说明菌株生长变慢，至35℃时，OD值开始迅速下降。整体而言，菌株ZJFLH3在25～35℃温度范围时生长良好，最适生长温度可确定为30℃。

2.3.2 酸碱度 菌株ZJFLH3在pH值小于5或大于8时均表现出极低生长速度;pH大于5.0时，生长速度迅速增加，至7.0时OD值达到最大值，大于7.0时，OD值下降迅速，整体而言，说明菌株ZJFLH3适宜于在中性偏酸性环境生长，在碱性环境生长速度受到明显抑制;当pH小于5或和大于8时，OD值都处于极低水平，说明强酸和强碱环境均不适合菌株生长。故菌株生长的适宜pH值范围认定为6～7，最适酸碱度环境为中性偏酸（图3）。

2.3.3 盐浓度 由图5可知，当NaCl含量介于0.15%～0.2%范围时，OD值均处于较高水平，变化幅度较小，说明此浓度范围适宜菌株ZJFLH3生长;当大于0.2%时，OD值下降迅速，当大于1%时，OD值开始维持在较低水平，说明不利于菌株生长;NaCl含量在0～0.1%范围内，OD值随浓度的提高而增大。整体而言，菌株ZJFLH3生长的适宜盐浓度范围是0.15%～0.2%，高盐不利于菌株生长。

3 讨论

土壤中的解磷微生物既有可以对有机磷进行降解矿化作用的类群，也有将无机固定态磷转化为可溶性磷的种类，故根据解磷菌作用对象的不同，可将解磷菌分为有机磷微生物和无机磷微生物[2-6]。本研究通过无机磷平板分离培养基分离获得的菌株ZJFLH3，形成的溶解圈明显。经过对连续发酵上清液中和培养基上清液中游离态磷含量的动态检测表明，游离态磷含量显著增加，且最大浓度达到了128.3μg/mL，因而可将菌株ZJFLH3定性为具有解磷功能菌株，可作为烟草生物磷肥开发研究的备用菌株资源。本研究还考察了温度、酸碱和盐浓度对菌株ZJFLH3生长发育的影响，该菌株适宜生长温度为25～35℃，适宜酸碱度为6～7，适宜盐浓度为0.15%～0.2%。

大量研究表明[10-12]，土著功能菌株天然的功能活性往往较低，很多菌株达不到直接开发成商品的条件，通过诱变育种提高功能菌株的功能活性，是后期研究的重点内容之一。因此，后续工作将开展对菌株ZJFLH3的诱变育种，提高解磷活性，并优化其发酵条件，为菌株ZJFLH3的开发用于提供更加充分的条件。

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（责编：王慧晴）