江 威，葛倩敏，黎 彪，袁 晴，梁荣斌，李秋玉，朱佩文，邓军萍，石文卿，邵 毅

0 引言

干眼(dry eye disease,DED)是眼表面多因子疾病，其可致使泪液渗透压增高和泪膜不稳定，眼表炎症和损伤以及神经感觉异常为其主要特征[1]，中、重度的DED可使患者生活质量下降，甚至产生一定的心理问题。近年来的研究表明，按照不同的标准，DED的总体发病率8.7%～30.1%[2-5]。雄激素可作用于泪腺，因此泪腺是其靶器官之一，泪腺的结构和功能，包括其细胞结构、基因表达、免疫活性等在雄激素的作用下可发生相当大的改变[6]。而雄激素缺乏则可能导致泪腺功能障碍或泪液缺乏，从而引起干眼[7]。针对因雄激素水平改变而导致干眼的患者进行了激素治疗的临床研究，但为减少副作用，目前的治疗仍以局部对症治疗为主。因此，目前较好地解决方案是探寻此前未曾使用的激素替代药物。糖可与绝大多数黄酮类化合物结合形成苷，并保存在植物的根、叶和果实里，其余的黄酮类化合物则以游离形式存在，具有多种生物活性，如抗炎、抗氧化、抗免疫及抗癌等作用[8]。桑色素(morin)则是其中一种，可从桑科植物中提取，通过雄激素受体结合，一定程度上发挥弥补雄激素不足的作用。本实验应用围绝经期雌兔造模，探究桑色素滴眼剂对干眼的治疗效果，为日后临床雄激素替代治疗提供一定的依据。

1 材料和方法

1.1材料从南昌大学动物实验室中选取6周龄的新西兰雌性白兔36只，要求所选雌兔体质量均为2.0～2.5kg。对所选取的雌兔的眼前节及眼底使用眼底镜、裂隙灯显微镜进行检查，SⅠt≥10mm/5min。本实验经伦理委员会审批，符合动物实验的相关准则。

1.2方法

1.2.1围绝经期雌兔干眼模型的构建参照文献[9]，随机选取36只雌兔，称重。腹腔注射足量的3%氨基甲酸乙酯溶液(45mg/kg)，然后将雌兔仰卧位放置，将头部及四肢固定并充分暴露其腹部，并使用电动剃刀对下腹部备皮。在使用碘伏对暴露的腹部进行消毒后，铺无菌巾单，无菌操作，并将手术刀经腹正中切口逐层剖入腹腔，行双侧卵巢切除术(orchiectomized，ORX)，然后依次关闭各层腹壁，连续缝合皮肤。术后连续3d行抗感染治疗，给予雌兔肌肉注射青霉素，并局部擦拭碘伏消毒。经过2mo观察后,被选取的雌兔角膜干燥且缺乏光泽,荧光素染色可见散布的点状溃疡，SⅠt<10mm/5min，泪膜破裂时间<12s。

1.2.2分组及处理将ORX术后2mo成功建模的24只雌兔随机分为对照组、实验组两组(每组为12只，且都选取右眼进行处理)：(1)对照组：对照磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)组；(2)实验组：桑色素组。对对照组和实验组雌性兔右眼连续滴眼6wk，4次/d。在治疗前、治疗后2、4、6wk时，分别对对照组和实验组雌性兔进行角膜泪液蛋白测定、角膜共聚焦显微镜检查、SⅠt检查及荧光素染色检测。

1.2.3实验动物造模及筛选标准为控制变量，24只雌兔全部由相同的操作者检查,以保证每次检查选取同一时间地点，且控制照明亮度不变，湿度和温度每次相同。经过2mo观察后,被选取的雌兔角膜干燥且缺乏光泽,荧光素染色可见散布的点状溃疡，SⅠt<10mm/5min，泪膜破裂时间<12s。

1.2.4桑色素提取液的制备

1.2.4.1提取根据参考文献[10]，将干燥桑科植物树叶碾碎，取碾碎后的粉末20g，置于具塞三角烧瓶中，然后将8倍量(体积分数70%)乙醇加入烧瓶中，摇匀后在室温下放置10h后，经过20min超声提取，过滤后再次将6倍量乙醇加入，再经5min超声提取后，过滤；准备一根离心管,将两次乙醇提取液一起加入其中，离心(2000r/min)，最后提取上清液。分别用1L乙酸乙酯和氯仿萃取，得到萃取液，使用HPLC-CL法检测桑色素含量。

1.2.4.2分离纯化用80～100目聚酰胺柱色谱法层析分离萃取液，分离完成后用70%乙醇洗脱。洗脱液以柱体积为单位进行浓度检测，重复上述纯化步骤直至得到较高纯度(>95%)的桑色素提取液[11]。

1.2.5桑色素滴眼剂的制备桑色素滴眼剂制备步骤：(1)溶解：提取物质量∶水比为0.1∶1.0；(2)加入眼润滑剂羧甲基纤维素(1.5g/L)；(3)缓冲：NaHCO3，KCl(0.1g/L以下)；(4)检测并调整理化特性：表面张力(40～50dyn/cm2)、屈光指数(1.336)、比重(约等于1)、渗透压(311～350mOsm)、黏稠度(略高于水)和pH值(7.3～7.8)；(5)加入保存剂：苯扎溴铵(0.05g/L)。

1.2.6 PBS滴眼剂的制备PBS滴眼剂制备步骤：(1)配制PBS缓冲液：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)：0.2g，加去离子水大约800mL将其混匀并且使固体完全溶解，再缓慢加浓盐酸直至调节酸碱度为7.4，最后定容到1L；(2)加入眼润滑剂羧甲基纤维素(1.5g/L)；(3)检测并调整理化特性：调至与桑色素滴眼剂相似；(4)加入保存剂：苯扎溴铵(0.05g/L)。

表1 两组治疗前后SⅠt及FL评分比较

注：aP<0.05vs对照组；cP<0.05vs治疗前。

1.2.7角膜荧光素染色及SⅠt检测角膜荧光素染色：使用10g/L荧光素钠点眼1滴后使雌兔立即瞬目，参照评分系统进行评分并分级[12]：0级：无染色；1级：很少的播散性污渍染色；2级：中度污渍染色，程度在1～3级间；3级：重度融合性污渍染色。

SⅠt检查泪液基础分泌情况。取出刻度滤纸并将其一边折叠，置于待检查雌兔眼下结膜囊的中外1/3处5min，并在取出试纸后测量其被浸润长度。参照文献[13]，SⅠt≥10mm/5min为正常。为控制变量，所有操作均由同一人完成。

1.2.8泪液蛋白测定从9∶00到11∶00取泪液样品，在泪河处取20μL无刺激性泪液，并储存在-80℃的冰箱保存。使用小牛血清白蛋白作为标准，通过Brandford方法测量泪液的总蛋白质含量。淀粉酶活性测定参照文献[14]：操作采用自动分析仪分析(LX20；Beckman，Fullerton，CA)，4,6-亚乙基-对硝基苯-α-D-麦芽七糖苷(ethylidene-4-nitrophenyl-α-d-maltoheptaoside，Leadman Group Co，Ltd.，Beijing，China)作为底物。

乳铁蛋白(lactoferrin，LF)测定参照文献[15]：从冰箱中取出10μL事先储存的泪液样品，稀释泪液样品，绘制出标准曲线并计算LF含量。通过比浊法测算溶菌酶含量，并参照说明书制作标准曲线、使用溶菌酶测试试剂盒，配制溶菌酶标准液和制备染色菌液;最后,把泪液样品和染色菌液混合摇匀，然后将混合液离心，获取上清液，泪液样品中溶菌酶含量可根据样品与测定管对照管光密度相差的数值，参照标准曲线计算出。

1.2.9共聚焦显微镜检查使用共聚焦显微镜对各组雌兔被测眼的角膜上皮的变化情况进行观察，由同一人实施检查。检查步骤：使雌兔头部固定，无法摇晃，让雌兔的眼睛直视前方，以5g/L的盐酸丙美卡因滴眼液点眼后，对中央角膜行全层检查，并保存清晰有效的图片，使用计算机软件测算炎症细胞和角膜上皮基底细胞的密度。神经密度(mm/mm2)：观察角膜下神经丛，采取35～50μm观察深度。应用AUTOCAD软件(Auto Desk Co.，Ltd,CA,US)确定角膜下神经纤维的长度。按实际角膜面积0.16mm2(400×400μm)/帧的标准获取每个图像，并描绘出观察到的单个图像中的神经纤维形状(图1，引自文献[16])，通过所描绘的折线特征得出折线的总长，然后将所得的折线总长比上面积的大小(0.16mm2)以计算出神经纤维密度(mm/mm2)。神经纤维分支:为每个图像中看到的总分支数。曲率评分：图像中神经纤维曲率的程度可分为4个等级。分数越高，则神经纤维曲率越高[14]。

2 结果

2.1两组治疗前后干眼相关指标比较治疗前，治疗后2、4、6wk，两组SⅠt比较，差异有统计学意义(F组间=9.92，F时间=10.16，F组间×时间=13.54，均P<0.05)。治疗前两组SⅠt相比较，差异无统计学意义(t=0.643，P>0.05)；与治疗前相比较，治疗2、4、6wk时实验组的SⅠt都产生了程度不一的改善，差异均有统计学意义(t=5.752，t=6.714，t=9.315，均P<0.05)，而对照组SⅠt较治疗前明显恶化，差异均有统计学意义(t=4.842，t=5.825，t=5.648，均P<0.05)；两组治疗2、4、6wk时SⅠt比较，差异均有统计学意义(t=4.436、6.763、11.658，均P<0.05)。治疗前，治疗后2、4、6wk，两组FL比较，差异有统计学意义(F组间=8.12，F时间=9.28，F组间×时间=15.14，均P<0.05)。治疗前两组FL评分比较，差异无统计学意义(t=0.526，P>0.05)；与治疗前相比，治疗2、4、6wk实验组FL评分均产生不同程度改善，差异均有统计学意义(t=5.763、5.653、3.542，均P<0.05)，对照组与治疗前比较，FL评分则明显恶化，差异均具有统计学意义(t=5.763、7.652、8.541，均P<0.05)；两组治疗2、4、6wk时FL评分比较，差异均有统计学意义(t=3.873、7.762、9.065，均P<0.05),见表1。

2.2两组治疗前后泪液蛋白比较治疗前，治疗后2、4、6wk两组溶菌酶含量比较，差异有统计学意义(F组间=12.38，F时间=10.72，F组间×时间=17.27，均P<0.05)。治疗前，治疗后2、4、6wk两组乳铁蛋白比较，差异有统计学意义(F组间=10.93，F时间=11.23，F组间×时间=20.83，均P<0.05)。治疗前，治疗后2、4、6wk两组淀粉酶活性比较，差异有统计学意义(F组间=11.78，F时间=14.95，F组间×时间=18.23，均P<0.05)。治疗前，治疗后2、4、6wk两组泪液总蛋白量比较，差异有统计学意义(F组间=9.43，F时间=10.43，F组间×时间=17.65，均P<0.05)，见表2。

治疗前两组溶菌酶含量、乳铁蛋白、淀粉酶活性和泪液总蛋白量无显著差别，差异均无统计学意义(t=8.425、9.532、9.672、5.267，均P>0.05)；经过6wk的桑色素处理，实验组溶菌酶含量、乳铁蛋白、淀粉酶活性和泪液总蛋白量与治疗前相比没有显著变化，差异均无统计学意义(t=10.732、8.541、7.542、10.764，均P>0.05)；而对照组在6wk PBS处理后与治疗前相比，溶菌酶含量、乳铁蛋白、淀粉酶活性和泪液总蛋白量都发生程度不一的降低，差异均有统计学意义(t=0.426、0.512、0.633、0.594，均P<0.05)；治疗2、4、6wk后两组溶菌酶含量、乳铁蛋白、淀粉酶活性和泪液总蛋白量相比，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

图1共聚焦显微镜下神经纤维形态A:AUTOCAD截取的共聚焦显微图像内的神经纤维；B:根据神经纤维描绘的折线。

图2两组雌性兔的角膜上皮下基底细胞图片A：对照组治疗前；B：对照组治疗6wk后；C：实验组治疗前；D：实验组治疗6wk后。

表2 治疗前后不同时间两组雌兔泪液蛋白比较

注：aP<0.05vs对照组；cP<0.05vs治疗前。

2.3两组治疗前后共聚焦显微镜观察图像分析治疗前可观察到角膜上皮基底细胞的边界较窄，可见光亮炎性细胞(图2A)。对照组治疗前、治疗后6wk，可观察到上皮基底细胞的密度显著增大，且上皮基底层观察到呈现为亮光样的炎性细胞(图2A、B)；而实验组在治疗前可观察到呈现为亮光样的炎性细胞(图2C)，但经6wk治疗后，炎性细胞的数目显著减少，而和正常雌性兔相比，上皮基底细胞的密度则略有下降(图2D)。经6wk治疗后，对照组炎症细胞密度为321±91个/mm2，上皮基底细胞密度为4436±289个/mm2，而实验组炎症细胞密度为36±11个/mm2，上皮基底细胞密度为3219±223个/mm2，两组差异有统计学意义(t=5.477、5.246，均P<0.05)。

对照组角膜的上皮下神经相对平直，并且较多(图3A)，6wk后其密度较治疗前减小，并可观察到多支神经纤维发生明显弯曲(图3B)。实验组角膜上皮下神经可见明显弯曲及分支(图3C)，治疗6wk后，其密度较治疗前增加，弯曲度明显减小(图3D)。

治疗前，治疗后2、4、6wk两组神经纤维密度相比，差异有统计学意义(F组间=15.22，F时间=14.51，F组间×时间=18.73，均P<0.05)。治疗前，治疗后2、4、6wk两组神经纤维分支相比，差异有统计学意义(F组间=7.53，F时间=8.77，F组间×时间=10.24，均P<0.05)。治疗前，治疗后2、4、6wk两组神经纤维曲率评分相比，差异有统计学意义(F组间=9.43，F时间=8.45，F组间×时间=12.84，均P<0.05)。

治疗前两组角膜上皮下神经比较，其密度大小、曲率评分、分支多少均未表现出明显差别，差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗6wk后，对照组角膜上皮下神经的曲率评分、分支多少和密度大小较治疗前明显改变，差异均有统计学意义(P<0.05)；与对照组和治疗前相比，实验组神经纤维曲率评分降低，分支数量显著减少，神经纤维密度增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

3 讨论

目前干眼症的发病人群正逐步朝着低龄化转变，但缺乏雄激素可以导致DED的发生，已有研究证明，雄激素在调节眼表和附属器官的过程中发挥了很大的作用[17]。其效应具有分子生物学基础，其调节涉及泪腺基因的表达[18]。受睾酮影响最大的基因包括与细胞生长，增殖和代谢，细胞通讯和运输，核酸结合，信号转导和受体活性相关的基因[18]。且雄激素的一些作用针对有丝分裂周期和DNA代谢的调节，这些反应可能可以促进上皮细胞增殖[19]。

干眼造模完成后，泪腺的解剖结构和生理功能遭受明显损害，其改变包括退行性改变，如生长和活动减少，腺体成分丢失，腺泡细胞大小减少，核体积和多态性减少，结缔组织增生，蛋白质水平中断，酶活性改变等[20]。同时，研究人员也报道，雄激素替代疗法可以逆转造模产生的影响，并可能引起组织结构，细胞活性和腺体分泌发生变化。这些改变可能包括腺泡上皮细胞活动活跃，出现丰富的糖蛋白分泌细胞，腺泡的增大，黏液和高度聚合的碳水化合物的生成，炎症的抑制以及泪液蛋白和液体分泌的变化[21-22]。因此，雄激素替代疗法在对因治疗上是较为有效的选择，但长期的激素应用有着严重的副作用，所以迫切需要寻找某种疗效佳且副作用相对较小的雄激素替代药物。

图3两组雌性兔角膜上皮下神经的图像A：对照组治疗前；B：对照组治疗6wk后；C：实验组治疗前；D：实验组治疗6wk后。

表3 两组雌兔治疗后角膜上皮下神经情况比较

注：aP<0.05vs对照组；cP<0.05vs治疗前。

黄酮类物质可以发挥拟雄激素的作用，有望作为雄激素替代药物，在一定程度上减轻雄激素减少带来的副作用[23]。桑色素可以从一些中草药以及桑科植物中提取获得，利用它与雄激素化学构型的相似性，与细胞膜雄激素受体结合发挥拟雄激素作用，通过对角膜、细胞凋亡和泪腺局部炎症反应产生影响从而达到治疗干眼症的目的。本实验研究结果表明，实验组在经过桑色素滴眼液处理后，其SⅠt明显增加，FL评分明显下降，并且溶菌酶含量、乳铁蛋白、淀粉酶活性和泪液总蛋白含量则仍可与治疗前保持相似的水平，而对照组的上述各项指标相较未处理时则显著变差，这意味着造模后的雌兔在经过桑色素滴眼液的处理后，其干眼症状在很大程度上得到了缓解。我们推测，这一作用可能是由于作为黄酮类物质的桑色素增加了泪腺组织的TGF-β1的表达，减少了IL-1β和TNF-α的表达，从而缓解了泪腺局部炎症反应。同时，通过应用桑色素，泪腺组织中bcl-2 mRNA的表达得以提高，最终抑制泪腺组织的细胞凋亡。并且，桑色素可能发挥了和雄激素类似的作用，调节了泪腺一些蛋白质的分泌量，并在某种程度上减少了MHC Ⅱ类抗原处理基因的泪腺表达，以及ASGPR1的表达[24]。

综上所述，桑色素滴眼液在一定程度上对消除围绝经期雌兔干眼的症状和维持泪液蛋白成分有一定作用，而且由于其给药方便，副反应较少，致使在未来临床应用中患者可能具有较高的依从性，因此具有广泛的临床应用价值。但是，对于桑色素滴眼液的临床应用，还需进一步的试验和验证。