彭晓芳，彭清华，彭 俊，周亚莎，张又玮，覃艮艳

0 引言

干眼是一种常见的眼表疾病，其病因复杂，尚无明确的病因，临床病程发展缓慢[1]，干眼发病率极高[2]，是近年眼科的研究重点、热点及难点。临床实践中，对于干眼的认识不断深入，2017年TFOS DEWS Ⅱ对干眼的定义进行了修改，干眼的新定义为:眼表的一种多因子疾病，特征是泪膜稳态的丧失并伴有眼表症状，其病因包括泪膜不稳定、泪液高渗性、眼表炎症与损伤和神经感觉异常[3]。目前干眼现有的治疗方法并不理想，各类西药均有各自的局限性，疗效不满意，甚至造成许多副作用[4-5]。

密蒙花是中国药典收载药品，也是眼科临床常用中药[6]。密蒙花有效成分为黄酮。我们基于中医古籍理论支持以及大量临床观察，制备了自制药物密蒙花滴眼液治疗干眼，并进行大量实验研究。前期临床及实验研究表明，密蒙花可以抑制泪腺细胞的凋亡[7-8]、显著调节泪腺局部炎症反应，参与抗干眼[9-10]。但密蒙花滴眼液对结膜炎性因子表达、泪膜稳定性的影响尚无研究。

故本实验通过对雄兔行双侧睾丸、附睾切除术，成功建立干眼模型后，使用不同浓度的密蒙花滴眼液对雄兔进行治疗，观察其对去势导致干眼雄兔结膜局部炎性因子IL-1β、黏蛋白5AC(MUC5AC)及P38MAPK表达的影响，从这些方面来评价密蒙花滴眼液对于干眼的疗效，从而为中医药治疗干眼提供现代理论依据和新的治疗方法。

1 材料和方法

1.1材料选取健康成年，无全身疾患的新西兰长耳大白兔36只，雄性，体质量1.5～2.0kg，湖南中医药大学动物实验中心提供，常规饲料喂养，自由进食。实验前行常规眼科检查(裂隙灯、眼底镜)，排除内外疾患方进入实验。密蒙花总黄酮和总苯丙素提取物由中南大学湘雅医院药剂科从密蒙花中提取；密蒙花不同浓度滴眼液由湖南中医药大学药学院制备；丙酸睾酮注射液(天津金耀药业有限公司)；注射用青霉素钠(广州白云山天心制药股份有限公司)；3%H2O2去离子水(中杉金桥)；磷酸盐缓冲液、25%乌拉坦(湖南福滋堂生物公司)；荧光素钠眼科检测试纸(天津晶明新技术开发有限公司)；DAB显色剂(重庆生物技术有限公司)。本实验得到湖南中医药大学动物伦理委员会审批。

1.2方法将36只健康成年雄兔按照随机排列表法分成6组，每组6只，空白组、模型组、密蒙花滴眼液低浓度组(1mg/mL)、中浓度组(1.5mg/mL)、高浓度组(3mg/mL)、睾酮组。除了空白组外，其余组均参照马轶群等[11]的方法，行双侧睾丸切除术(ORX)，将模型组、密蒙花滴眼液低浓度组(1mg/mL)、中浓度组(1.5mg/mL)、高浓度组(3mg/mL)、睾酮组五组实验兔以25%乌拉坦注射液0.4mL/100mg耳缘静脉麻醉，雄兔取仰卧位，四肢张开并固定，下腹部褪毛剂褪毛，阴囊皮下加用2%利多卡因局部麻醉，碘伏消毒，铺无菌巾单，将一侧辜丸由腹腔挤入阴囊并捏紧。用消毒刀片将阴囊切一小口，用力挤出睾丸，结扎精索静脉及输精管，切除睾丸及附睾，连续缝合阴囊皮肤后局部涂碘酊预防感染。另侧睾丸及附睾同法切除。术中静脉滴注生理盐水100mL，内加青霉素40万U，术后连续3d肌肉注射青霉素针40万U，预防感染。造模8wk后检查模型。各组动物均由同一人检查，各组动物每次检查时间、地点、照明温度、湿度及亮度相同。模型制作成功标准：检查干眼模型兔见角结膜外观干燥，泪液量少，SchirmerⅠ试验值(SⅠt)均<10mm/5min(空白组均>10mm/5min)；BUT均<10s；荧光素染色见角结膜点、片状着色。实验过程中，密蒙花滴眼液中浓度组及睾酮组各死亡1只。其余兔造模成功后，空白组和模型组不予以处理，密蒙花滴眼液低浓度组(1mg/mL)、中浓度组(1.5mg/mL)、高浓度组(3mg/mL)给予密蒙花不同浓度滴眼液，3次/d，睾酮组按0.5mL/kg剂量在大腿肌肉处注射丙酸睾酮，每3d 1次，用药时间为4wk。常规喂养。各组分别于造模前及用药4wk后，用25%乌拉坦全身麻醉后，对兔子进行SchirmerⅠ试验、BUT及角膜荧光素染色检测。用药后4wk当天不予以治疗，全身麻醉下以空气栓塞法处死，即刻取出球结膜，放入多聚甲醛中固定24h，常规石蜡包埋切片，采用免疫组织化学方法严格按照说明书操作检测IL-1β、MUC5AC、P38MAPK。

表1 各组兔造模前和用药4wk后SⅠt值比较

注：低浓度组为密蒙花滴眼液1mg/mL；中浓度组为密蒙花滴眼液1.5mg/mL；高浓度组为密蒙花滴眼液3mg/mL。

2 结果

2.1各组兔造模前和用药4wk后SⅠt值比较造模前各组SⅠt值比较差异无统计学意义(F=0.64，P>0.05)。空白组、密蒙花滴眼液中浓度组、高浓度组、睾酮组自身前后对比差异均无统计学意义(P>0.05)，密蒙花滴眼液低浓度组和模型组自身前后比较差异有统计学意义(P<0.05)。用药4wk后,各组之间SⅠt值比较差异有统计学意义(F=37.94，P<0.01)，模型组与其余各组比较差异均有统计学意义(t模型组vs空白组=12.65，P模型组vs空白组<0.01；t模型组vs低浓度组=5.14，P模型组vs低浓度组<0.01；t模型组vs中浓度组=9.09，P模型组vs中浓度组<0.01；t模型组vs高浓度组=9.55，P模型组vs高浓度组<0.01；t模型组vs睾酮组=7.18，P模型组vs睾酮组<0.01)，密蒙花滴眼液低浓度组与中浓度组、高浓度组比较差异均有统计学意义(t低浓度组vs中浓度组=3.95，P低浓度组vs中浓度组<0.05；t低浓度组vs高浓度组=4.41，P低浓度组vs高浓度组<0.05；)，但密蒙花滴眼液中浓度组与高浓度组比较差异无统计学意义(t中浓度组vs高浓度组=0.46，P中浓度组vs高浓度组>0.05)，见表1。

表2 各组雄兔用药4wk后角膜荧光素染色情况比较 眼

注：低浓度组为密蒙花滴眼液1mg/mL；中浓度组为密蒙花滴眼液1.5mg/mL；高浓度组为密蒙花滴眼液3mg/mL。

2.2各组兔用药4wk后角膜荧光素染色情况比较造模前，各组大鼠角膜均透明、润泽，荧光素染色阴性；造模成功用药4wk后，模型组、密蒙花滴眼液各浓度组、睾酮组均有着染，其中，模型组着染最明显。对各组大鼠角膜荧光素染色情况采用Kruskal-WallishH检验方法，结果显示各组之间差异有统计学意义(χ2=45.314，P<0.01)，见表2。

2.3各组兔造模前和用药4wk后BUT值比较造模前各组BUT值比较差异无统计学意义(F=0.60，P<0.01)，空白组、密蒙花滴眼液各浓度组及睾酮组自身前后对比差异均无统计学意义(P>0.05)，模型组自身前后比较，BUT值明显减小，差异有统计学意义(P<0.01)。用药4wk后，各组之间比较差异有统计学意义(F=32.91，P<0.01)。模型组与其余各组比较差异均有统计学意义(t模型组vs空白组=10.51，P模型组vs空白组<0.05；t模型组vs低浓度组=6.31，P模型组vs低浓度组<0.01；t模型组vs中浓度组=8.74，P模型组vs中浓度组<0.01；t模型组vs高浓度组=9.06，P模型组vs高浓度组<0.01；t模型组vs睾酮组=11.04，P模型组vs睾酮组<0.01)。密蒙花滴眼液低浓度组与中浓度组、高浓度组比较差异均有统计学意义(t低浓度组vs中浓度组=2.42，P低浓度组vs中浓度组<0.05；t低浓度组vs高浓度组=2.51，P低浓度组vs高浓度组<0.05)，但密蒙花滴眼液中浓度组与高浓度组比较差异有统计学意义(t中浓度组vs高浓度组=1.21，P中浓度组vs高浓度组<0.05)。密蒙花高浓度组与睾酮组比较差异有统计学意义(t高浓度组vs睾酮组=2.31，P高浓度组vs睾酮组<0.05)，见表3。

2.4免疫组织化学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，该实验数据为定性资料，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.4.1各组兔用药4wk后IL-1β水平比较各组兔用药4wk后IL-1β水平比较，差异有统计学意义(F=62.731，P<0.01)。模型组与其余各组比较差异均有统计学意义(t模型组vs空白组=16.18，P模型组vs空白组<0.01；t模型组vs低浓度组=7.64，P模型组vs低浓度组<0.01；t模型组vs中浓度组=10.18，P模型组vs中浓度组<0.01；t模型组vs高浓度组=10.27，P模型组vs高浓度组<0.01；t模型组vs睾酮组=12.36，P模型组vs睾酮组<0.01)；密蒙花滴眼液低浓度组与中浓度组、高浓度组、睾酮组比较，IL-1β表达增加，差异均有统计学意义(t低浓度组vs中浓度组=2.55，P低浓度组vs中浓度组<0.05；t低浓度组vs高浓度组=2.64，P低浓度组vs高浓度组<0.05；t低浓度组vs睾酮组=4.73，P低浓度组vs睾酮组<0.05)；密蒙花滴眼液中浓度组和高浓度组比较差异无统计学意义(t=0.09，P>0.05)；密蒙花滴眼液高浓度组与睾酮组比较差异有统计学意义(t=3.09，P<0.05),见表4及图1。

2.4.2各组兔用药4wk后MUC5AC水平比较各组兔用药4wk后MUC5AC水平比较差异有统计学意义(F=46.098，P<0.01)。模型组与其余各组比较差异均有统计学意义(t模型组vs空白组=14.79，P模型组vs空白组<0.01；t模型组vs低浓度组=4.93，P模型组vs低浓度组<0.01；t模型组vs中浓度组=8.09，P模型组vs中浓度组<0.01；t模型组vs高浓度组=8.45，P模型组vs高浓度组<0.01；t模型组vs睾酮组=9.18，P模型组vs睾酮组<0.01)；密蒙花滴眼液低浓度组与中浓度组、高浓度组、睾酮组比较，阳性表达减少，均有统计学意义(t低浓度组vs中浓度组=3.16，P低浓度组vs中浓度组<0.05；t低浓度组vs高浓度组=3.52，P低浓度组vs高浓度组<0.05；t低浓度组vs睾酮组=4.28，P低浓度组vs睾酮组<0.05)；密蒙花滴眼液中浓度组和高浓度组、睾酮组比较差异均无统计学意义(t中浓度组vs高浓度组=0.36，P中浓度组vs高浓度组>0.05；t中浓度组vs睾酮组=1.09，P中浓度组vs睾酮组>0.05)；密蒙花滴眼液高浓度组与睾酮组比较差异无统计学意义(t=0.73，P>0.05)，见表4及图2。

图1用药4wk后免疫组化观察IL-1β的表达(×400)A：空白组结膜上皮细胞中可见极少量IL-1β阳性表达;B：模型组结膜上皮可见大量棕黄色颗粒沉着，阳性表达明显增多;C:密蒙花滴眼液低浓度组结膜上皮细胞阳性表达较空白组增多，但较模型组少;D:密蒙花滴眼液中浓度组结膜上皮细胞可见少量IL-1β阳性表达，但较模型组明显减少;E:密蒙花滴眼液高浓度组结膜上皮细胞中可见少量阳性表达，较模型组明显减少;F:睾酮组结膜上皮细胞中可见少量阳性表达，较密蒙花滴眼液高浓度少。

表3 各组兔造模前和用药4wk后BUT比较

注：低浓度组为密蒙花滴眼液1mg/mL；中浓度组为密蒙花滴眼液1.5mg/mL；高浓度组为密蒙花滴眼液3mg/mL。

表4 用药4wk后各组兔结膜细胞中IL-1β和MUC5AC及P38MAPK平均光密度值

注：低浓度组为密蒙花滴眼液1mg/mL；中浓度组为密蒙花滴眼液1.5mg/mL；高浓度组为密蒙花滴眼液3mg/mL。

图2用药4wk后免疫组化观察MUC5AC的表达(×400)A：空白组结膜上皮细胞中可见大量MUC5AC阳性表达，高于其它各组;B：模型组结膜上皮可见极少量MUC5AC，阳性表达明显减少;C：密蒙花滴眼液低浓度组结膜上皮细胞阳性表达较空白组少，但较模型组多;D：密蒙花滴眼液中浓度组结膜上皮细胞可见较多阳性表达，较模型组明显增多;E：密蒙花滴眼液高浓度组结膜上皮细胞中可见较多阳性表达，较模型组明显增多;F：睾酮组结膜上皮细胞中可见大量阳性表达。

图3用药4wk后免疫组化观察P38MAPK的表达(×400)A：空白组结膜上皮细胞中可见极少量P38MAPK阳性表达;B：模型组结膜上皮可见大量棕黄色颗粒沉着，阳性表达明显增多(箭头示);C：密蒙花滴眼液低浓度组结膜上皮细胞阳性表达较空白组增多，但较模型组少;D：密蒙花滴眼液中浓度组结膜上皮细胞可见少量阳性表达，但较模型组明显减少;E：密蒙花滴眼液高浓度组结膜上皮细胞中可见少量阳性表达，较模型组明显减少;F：睾酮组结膜上皮细胞中可见少量阳性表达，较高浓度少。

2.4.3各组兔用药4wk后P38MAPK水平比较各组兔用药4wk后P38MAPK水平比较，差异有统计学意义(F=162.058，P<0.01)。模型组与其余各组比较差异均有统计学意义(t模型组vs空白组=27.24，P模型组vs空白组<0.01；t模型组vs低浓度组=9.65，P模型组vs低浓度组<0.01；t模型组vs中浓度组=13.91，P模型组vs中浓度组<0.01；t模型组vs高浓度组=14.40，P模型组vs高浓度组<0.01；t模型组vs睾酮组=17.87，P模型组vs睾酮组<0.01)；密蒙花滴眼液低浓度组用药4wk后P38MAPK水平与中浓度组、高浓度组、睾酮组比较，阳性表达增加，均有统计学意义(t低浓度组vs中浓度组=4.26，P低浓度组vs中浓度组<0.05；t低浓度组vs高浓度组=4.75，P低浓度组vs高浓度组<0.05；t低浓度组vs睾酮组=8.22，P低浓度组vs睾酮组<0.05)；密蒙花滴眼液中浓度组和高浓度组比较差异无统计学意义(t=0.48，P>0.05)；密蒙花滴眼液中浓度组与睾酮组比较差异有统计学意义(t=8.22，P<0.05)；密蒙花滴眼液高浓度组与睾酮组比较，差异有统计学意义(t=3.47，P<0.05)，见表4和图3。

3 讨论

目前干眼的病因尚未明确，干眼的致病因素多而复杂，包括有眼表炎症、性激素失衡、神经机能障碍、维生素A缺乏和免疫功能紊等，其中，炎症在干眼发病机制中的重要性已得到充分证明。多种炎症因子通过交互构成的细胞因子网络，使眼表组织炎症反应加重。2017年TFOS DEWS Ⅱ在生物性别、社会性别及激素报告中详细论述了性激素(如雄激素和雌激素)、下丘脑-垂体激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1、糖皮质激素和甲状腺激素对性别相关的眼部差异的影响，其中性激素的作用尤为重要[12-13]。本实验以此为依据，通过免疫组织化学分析发现，去势雄兔干眼模型组结膜中可见大量炎性细胞浸润，IL-1β有较强的阳性表达，说明干眼发病过程中结膜组织有炎症浸润。密蒙花滴眼液各浓度治疗后，炎性细胞表达较模型组明显减少，充分说明密蒙花滴眼液对干眼眼表炎症有改善作用，但作用弱于雄激素。同时，密蒙花中、高浓度组对于炎症改善作用强于低浓度组。

泪液渗透压的升高和泪膜不稳定是干眼发生的两大核心机制，如眼表上皮的杯状细胞可以分泌成胶型黏蛋白，黏蛋白的作用很多，如影响细胞生长、分化、免疫、减少摩擦、润滑眼表、减少干燥环境对黏膜上皮细胞的损害，从而对泪膜稳定性的维持具有重要作用。黏蛋白主要有7种，而黏蛋白MUC5AC是构成泪膜黏液层的最主要成分，在维持眼表稳定方面发挥着主要作用[14-15]。本实验发现干眼病程中结膜上皮杯状细胞分泌MUC5AC量较空白组减少，经过密蒙花滴眼液局部治疗后，增加了结膜中MUC5AC的表达，同时，密蒙花中、高浓度组对于眼表MUC5AC的分泌作用高于低浓度组。

MAPK参与指导细胞对各种刺激的反应，如促细胞分裂素、渗透压、热休克和促炎细胞因子。它们调节细胞功能，包括增殖，基因表达、分化、有丝分裂、细胞存活和细胞凋亡[16]。本实验对去势后结膜中P38MAPK表达进行比较，发现去势雄兔模型组结膜中可见大量P38MAPK阳性表达，说明P38MAPK与干眼密切相关。密蒙花滴眼液各浓度滴双眼治疗后，密蒙花滴眼液通过下调P38MAPK蛋白含量，从而下调炎症因子的表达，其中密蒙花中、高浓度组作用强于低浓度组。我们认为密蒙花滴眼剂可能是通过干预P38MAPK通路，来阻断相关炎症反应，从而改善眼表症状，但具体的调节机制有待进一步的研究。

总之，密蒙花滴眼液可以下调去势雄兔干眼结膜组织中IL-1β、P38MAPK的表达，增加MUC5AC的表达，从而减少干眼结膜组织的炎症浸润，维持泪膜稳定性，本研究表明密蒙花滴眼液对干眼有一定的疗效，为干眼治疗提供了新思路，有广阔的应用前景。但具体的作用机制还有待进一步的研究。