李加林，冯 睿，张嘉文，吴素珍

(赣南医学院 1.中药学教研室；2.2014级本科中药学专业；3.2019级硕士研究生；4.生物化学与分子生物学教研室，江西 赣州 341000)

慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一种因为造血干细胞异常而影响血液、骨髓等的恶性肿瘤疾病，约占全部癌症的0.3%，约占白血病里的20%[1]。它具有恶性侵袭、凋亡受抑和增生不休的的特征，如果不接受治疗，最后会导致患者死亡[2-3]。恶性肿瘤的产生是一个由许多因素引起的并且非常复杂的过程，其中细胞增殖与细胞凋亡的不平衡是其发生的最主要的原因[4]。细胞凋亡可以使机体内过量的、被破坏的、不正常的细胞被及时清理。细胞凋亡不仅在细胞各个周期中起着重要作用，并且在肿瘤的产生、发展、治疗等其他方面具有非常重要的意义。在肿瘤生成的过程中，细胞凋亡的主要能力是负调控，它能够阻止肿瘤细胞飞速增长。涉及细胞凋亡的基因能划分为两种，第一种为促凋亡基因，第二种为抗凋亡基因。肿瘤的形成的原因之一就是细胞阻止凋亡的基因被激活或者促凋亡的基因被抑制，导致细胞无法死亡而一直生存下去。在抑制凋亡的基因中，最重要的是B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)[5]。许多由于细胞毒素引发的细胞死亡可由Bcl-2抑制，它的过度表达可以增强细胞对许多DNA损害因素的抵抗性，从而抑制细胞凋亡[6]。许多研究表明Bcl-2是细胞凋亡的多种信号路径的相交点。

Caspase又称为凋亡蛋白酶，存在于细胞质中。因它被激活或者超量表达都会使细胞不可逆的迈向死亡，是在细胞凋亡里起到关键性作用的蛋白酶家族，而被称做细胞凋亡的执行者和起始者。研究表明，细胞凋亡是因为caspase逐渐发生级联反应造成的。细胞凋亡中最重要的终末剪切酶是caspase-3，它处于caspase级联反应的后部，可剪切caspase-2、6、7、9的前体，这种剪切是细胞程序性死亡关键的一部分[7]。

如今，对于白血病大多依旧采用联合化疗的手段进行治疗，虽然它的效果会比采用单一药物治疗好的多，但是依旧会产生很大的不良反应，会对人体的免疫系统以及造血系统产生损伤。一些化疗药物虽然对白血病细胞有抑制作用，但是也会使正常细胞受到损伤[8]。随着研究的不断深入，人们发现从中药中寻找既有效，不良反应又小的抗肿瘤药物具有重要意义[9]。龙须藤来源于豆科羊蹄甲属植物龙须藤[Bauhiniachampionii(Benth.) Benth.]的干燥藤茎[10]。龙须藤分布较广，资源丰富，有止痛活血，健脾理气，祛风湿的作用[11-12]。该植物中主要含有黄酮类、多糖、甾醇类、挥发油、芳香酸类、萜类等化合物[13]，研究表明，龙须藤多甲氧基黄酮存在38个与癌症有关的潜在靶点，而且多数集中于白血病、胰腺癌等方面[14]。还有研究发现，高剂量的多甲氧基黄酮对SW1353细胞的活性存在明显的抑制作用[15]。有研究表明，5,7,3',4',5'-五甲氧基黄酮(5,7,3',4',5'-pentamethoxyflavone，PMF)可以很好的降低小鼠腺癌的发生概率，而且在黄酮分子骨架中含有的甲氧基部分可以提高预防癌症的作用[16]。

本实验使用人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞，研究从龙须藤中提取出来的一种多甲氧基黄酮PMF对其增殖和凋亡的影响，探讨PMF能否促进K562细胞的凋亡。

1 材料与方法

1.1实验材料人白血病细胞细胞株K562(由广州莱德尔生物科技有限公司提供)，5,7,3',4',5'-五甲氧基黄酮(由赣南医学院天然药物研究与开发重点实验室提供，经HPLC检测其含量>95%)，胎牛血清(Gibco)，RPMI-1640培养基(Hyclone)，青链霉素(Hyclone)。苏州安泰洁净工作台(SW-CJ-IFD)，倒置光学显微镜 (Nikon)，Multiskan FC酶标仪(Thermo公司)，细胞恒温培养箱(Thermo公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养将细胞放置在温度恒定为37 ℃、二氧化碳浓度为5%、湿度为95%的培养箱内静置培养。每天使用倒置显微镜观察其生长的状况，取处于对数生长期的细胞开展实验。

1.2.3吖啶橙(AO)染色法检测细胞凋亡取处于对数生长期的细胞，用不同剂量的PMF处理24 h，1 000 rpm离心，时间为10 min，然后收集细胞，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤，再离心。将吖啶橙稀释至终浓度为0.01%后，加入用PBS稀释到一定浓度的细胞悬液中，避光反应10 min，在荧光显微镜下观察。

1.2.4蛋白免疫印迹(WesternBlot)法检测细胞中Bcl-2、caspase-3蛋白表达当K562细胞处于对数生长期时，将其移入4个小培养皿饥饿1晚，隔天将其分为正常组(不给药)、低剂量组(35 μg·mL-1PMF)、中剂量组(70 μg·mL-1PMF)、高剂量组(140 μg·mL-1PMF)，分别给不同剂量的PMF，24 h后收细胞。将培养皿中细胞吹打混匀，分别放入对应的离心管中，采用低温离心机，调整温度为4 ℃，12 000 g离心10 min，吸去上清液，用PBS磷酸盐缓冲液洗涤后再次同条件离心，重复以上步骤3次。配制裂解液需要取1 mL RIPA裂解液，加入10 μL PMSF和20 μL蛋白酶抑制剂cocktail，混匀。在已经弃去上清液的离心管中加入新配的裂解液120 μL，放在冰上裂解10 min。用5%的牛血清白蛋白按比例溶解一抗(β-actin 1∶1 000，Bcl-2 1∶3 000，caspase-3 1∶2 000)，在4 ℃条件下，用一抗将已封闭的NC膜摇床孵育过夜，第2天将一抗回收，用1×TBST洗3次NC膜，每次需要10 min，以洗去多余的抗体。接着用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔(β-actin 1∶10 000，Bcl-2 1∶20 000，caspase-3 1∶10 000)，最后用凝胶成像系统来检测蛋白免疫印迹信号，蛋白的表达量用灰度值来表示。

2 结 果

2.1MTT法检测PMF对K562细胞增殖的影响从表1可知，PMF处理后的细胞OD值明显比正常组小，差异有统计学意义(P<0.05)，表明低、中、高剂量的PMF对K562细胞均有抑制作用。随着PMF剂量的增加，K562细胞的OD值明显降低，表明这种抑制作用具有浓度依赖性，高剂量的PMF抑制其增殖效果较好。从图1可以直观的看出，PMF对K562细胞的抑制率随着剂量的增长而升高。

表1 PMF对K562细胞增殖抑制的影响

注：与正常组比较，*P<0.05。

图1 PMF对K562细胞的抑制率

注：正常组的PMF的含量为0 μg·mL-1；低剂量组的PMF含量为35 μg·mL-1；中剂量组的PMF的含量为70 μg·mL-1；高剂量组的PMF含量为140 μg·mL-1。与正常组比较，*P<0.05。

2.2吖啶橙(AO)染色观察PMF对K562凋亡的影响吖啶橙染色显示，正常的细胞核呈均匀的弥散的荧光，荧光较暗。经过PMF处理后的细胞，出现非常典型的凋亡状态，其细胞核缩小，呈聚缩状态或破裂，染色加深，呈现颗粒状或团块状的强荧光。并且随着PMF剂量的提高，凋亡的细胞数目变多(图2)。

2.3PMF对K562细胞Bcl-2、caspase-3蛋白表达的影响分别用低、中、高剂量的PMF处理以后的K562细胞Bcl-2蛋白表达量均比正常组低，差异有统计学意义(P<0.05)。随着PMF剂量的渐渐提高，Bcl-2的蛋白表达量不断下调。与正常组相比，分别用低、中、高剂量的PMF处理以后的K562细胞caspase-3蛋白表达量均比正常组高(P<0.05)。并且随着PMF剂量的不断提高，caspase-3的表达渐渐升高。蛋白的相对表达量=目的蛋白的表达水平/(β-actin的蛋白表达水平)。Bcl-2蛋白相对表达量柱状图提示抗凋亡的蛋白表达逐渐下降，caspase-3蛋白相对表达量柱状图也表明了促凋亡的蛋白表达上调(图3)。以上结果说明，PMF可以抑制K562细胞Bcl-2表达，对K562细胞caspase-3表达具有促进作用。

图2 PMF对K562细胞影响的形态学观察

图3 PMF对K562细胞Bcl-2和caspase-3表达的影响

3 讨 论

白血病大多仍然采用联合化疗的方式治疗，虽然它的效果会比采用单一药物治疗好的多，但是依旧会产生很大的不良反应，而且还有很大复发的可能性。随着研究的不断深入，引导细胞凋亡越来越成为治疗白血病的热门方法。在治疗血癌的方面，中药有着极为漫长的历史。PMF有很强的药理作用，是一种很好的抗癌物质。许多研究者提取多甲氧基黄酮进行研究，并且对该化合物的抗风湿、镇痛抗炎作用有所报道。虽然对肿瘤细胞的抑制作用和促进肿瘤细胞凋亡方面的研究并没有很多，但是PMF的抗肿瘤作用已经得到了证实[16]。通过MTT实验，我们发现PMF可以抑制K562细胞的增殖，且随着剂量的增加抑制呈上升趋势。经由吖啶橙染色可以清晰地观察到K562细胞的凋亡现象。经过Western Blot实验发现，Bcl-2的表达下调，caspase-3的表达上调，这些说明PMF具有抑制K562细胞增殖的活性，诱导K562细胞凋亡。但是余方荣使用MTT法测各种浓度梅花入骨丹总黄酮处理的人软骨细胞活性，发现低剂量的梅花入骨丹总黄酮会提高SW1353细胞的活性，而高剂量的梅花入骨丹总黄酮会明显抑制SW1353细胞的生长活性[17]。这与本实验所得出的K562的细胞增殖会受到低剂量的PMF的抑制的结果不一致。该情况可能是因为黄酮类化合物的活性中心是α，β不饱和吡喃酮，A、B、C三环上的取代基会决定该黄酮类化合物特殊的药理作用。余方荣的研究使用的是总黄酮，而PMF是一种已经经过提取分离的中药活性单体，这两种物质是不相同的。总黄酮里的其他有效成分即使为低剂量可能会有更强的增加肿瘤细胞活性的作用，从而掩盖了抑制其活性的那些成分。但是一旦提高了剂量，抑制肿瘤细胞活性的成分将会发挥更大的作用。PMF对K562细胞增殖的抑制作用即通过抑制Bcl-2表达，提高caspase-3的蛋白表达，促进K562细胞凋亡。本研究将为PMF作为抗白血病药物的开发研究提供实验基础，其作用机理还有待深入研究。