张 洲 陈 鹏 章 琴 奚士航 王 峻 王小明

1 皖南医学院第一附属医院弋矶山医院肝胆外科,安徽省芜湖市 241001； 2 皖南医学院研究生学院

目前胰腺癌在消化道恶性肿瘤疾病中并不少见，具有高度恶性，对放疗和化疗不敏感，使得临床治疗非常困难。患者的预后也很差，5年生存率低于5%，长期生存率低于15%，在欧洲和美国癌症相关死亡人数中排名第四，俗称“癌症之王”[1]。由于胰腺癌患者早期症状不典型，早期诊断不易，大部分患者就诊时已是晚期。目前，不到20%的患者在确诊后进行手术治疗，手术治疗患者的中位生存期仅为12.6个月，未经外科治疗的患者中位生存期仅3.5个月。即使患者得到手术根治，亦需要面对高复发率和转移率的风险[2]。长链非编码 RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一类长度超过200核苷酸的 RNA分子，不编码蛋白，位于细胞核或胞质内[3-4]。微小RNA(MiRNA)是长度为18～23bp的内源非编码单链RNA分子。他们均与胰腺癌的生物学特性有密切联系[3-5]。因此，本研究通过对LncRNA XIST及MiRNA-101在基因层面的表达分析来映射临床病理特征，找出其中的相关性，为其在临床上用作诊断标记物或是分子治疗靶标提供相关依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2017年2月—2019年4月于我院行胰腺癌手术患者共50例，术后病理均为原发胰腺癌，其中胰腺导管腺癌46例，腺泡细胞癌1例，导管黏液癌3例，男29人，女21人，根据TNM标准Ⅰ期2例，Ⅱ期24例，Ⅲ期24例。所有患者在术前均未行任何化放疗治疗。

1.2 材料 TRIzol RNA分离试剂为赛默飞公司产品、RNA提取所需化学试剂均来自Biosharp公司，西格玛低温高速离心机。PCR引物合成由广州锐博生物科技有限公司提供，所有实验试剂盒(逆转录、基因扩增试剂盒)均购自宝生物(Takara)公司。

1.3 方法

1.3.1 总RNA：提取收集50例患者术中切除的肿瘤组织及癌旁组织块(1.0cm×1.0cm×1.0cm)置于冷冻管中并储存在液氮中(25例为手术切除的肿瘤组织，25例为手术切除的癌旁组织)。每例各取肿瘤组织标本200mg，癌旁组织200mg作为对照，均在液氮中匀浆器研磨后将组织样品按200mg加入1ml Trizol，转移入离心管。以12 000转/min离心5min，弃去沉淀，每个试管中加入200μl氯仿，并盖上管。用手摇动15s，在室温下静置10min，在4℃下以12 000转/min离心14min，并吸出上层水相。移至另一个新的离心管中，每1ml Trizol加入0.6ml异戊醇，混合并静置5～10min。然后，在4℃下以12 000转/min离心4min，弃去上清液，每个试管再加入1ml 75%乙醇，轻轻摇动混合物以悬浮沉淀物，获得总RNA。

1.3.2 LncRNA XIST、MiRNA-101表达水平检测：在Microtube管中配制加入 LncRNA XIST、 MiRNA-101引物的总 RNA反转录反应混合液，变性和退火在 PCR机上在65℃下进行5min和4℃以获得变性和退火的反应溶液。离心片刻后，将模板RNA /引物等的混合物收集在Microtube管底。将5×PrimeScriptTM缓冲液的逆转录反应溶液加入上述 Microtube管中，逆转录反应在 PCR机上在以下条件下于40℃进行15min或95℃进行5min，反应完成后4℃冷却；使用PCR扩增试剂盒，将得到的cDNA分别加样，上机行Real time-PCR反应，程序为：95℃预变性2min；95℃ 15s，60℃ 1min，循环45次；之后95℃变性1min，将其冷却至55℃，记录ct值以计算基因的相对表达量。

1.4 统计学方法 统计学处理使用Graphpad Prism7.0及SPSS22.0，测得数据以均数±标准差表示，无序数据采用χ2检验；等级资料及有序计数数据以频数和百分比(%)表示，采用秩和检验：检验水准为α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组织LncRNA XIST表达差异与临床病理特征相关性 在本次研究收集标本中，LncRNA XIST表达量2-ΔΔct>1.5的有34例， LncRNA XIST表达量增高与肿瘤组织学分化具有负相关性(P<0.05)，与患者淋巴结转移、神经脉管侵犯、肿瘤位置大小、浸润深度及TMN分期等无关(P>0.05)。

2.2 胰腺癌组织MiRNA-101表达差异与临床病理特征相关性 在本研究收集标本中，MiRNA-101表达量2-ΔΔct>1.5的有29例，MiRNA-101表达量增高与肿瘤的大小、浸润深度及TMN分期具有负相关性(P<0.05)，与淋巴结转移、神经脉管侵犯、肿瘤位置、肿瘤组织学分化等无关(P>0.05)。见表1。

表1 胰腺癌患者临床病理特征与LncRNA XIST及MiRNA-101表达相关性

3 讨论

迄今，胰腺癌其发病机理尚未彻底阐明，导致临床治疗常常举步维艰，患者5年生存率非常低且发病率居高不下。胰腺癌的早期症状不明显，且相当多的患者在就诊时已进入晚期，失去最佳手术时机且长期预后不良[6]。因此，早期发现对于改善胰腺癌患者的临床预后和延长生存期至关重要[7]。

LncRNA XIST是X染色体失活特异转录本(X-inactive specific transcript, Xist)，可以特异性地结合X染色体中的特定位点，介导X染色体失活[8-9]。目前已知MiRNA的序列结构在各个物种间具有高度的进化保守性[10]。MiRNA与下游靶mRNA的3’端非翻译区相结合，从而调控靶基因的表达和相关分子信号通路的活性，参与胰腺癌细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程[11]。笔者认为胰腺癌的发生与原癌基因的失活到致癌基因的激活有关，再追溯到原癌基因中某一编码基因的某个位点被沉默致使不再发挥编码蛋白的作用， LncRNA XIST在其中发挥了至关重要的作用，从本次临床相关性研究来看，肿瘤组织学分化低的标本与LncRNA XIST的表达密切相关，LncRNA XIST可能有助于胰腺癌的发展及更进一步的恶性程度转变。更进一步分析，本次研究结果显示MiRNA-101表达量高的标本其肿瘤浸润深度及临床分期均较乐观，推测MiRNA-101可能是胰腺癌的抑癌基因，并为LncRNA XIST的靶基因之一，受LncRNA XIST的调控且抑制其在胰腺癌肿瘤组织中的表达，致使肿瘤组织更进一步的增殖、浸润与转移。本次研究并不能发掘LncRNA XIST、MiRNA-101之间是否存在相互关联共同作用于胰腺癌，尚待进一步研究分析。然而，也许LncRNA XIST表达增高是胰腺癌分化不良的危险因素，MiRNA-101表达量降低是胰腺癌增殖、浸润与转移的危险因素。

综上所述，LncRNA XIST和MiRNA-101在一定程度上与胰腺癌的分化和发展存在相关联系，有望作为诊断性标志物和分子治疗靶点而应用于临床。