单体江，段志豪*，吴春银，李志强，王 松，毛子翎**

(1. 华南农业大学林学与风景园林学院，广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广州 510642；2. 广东省生物资源应用研究所，广州 510260)

杜比亚蟑螂Blapticadubia又名度比亚大蠊、度比亚蟑螂，属蜚蠊目Blattaria、蜚蠊科Blattidae碧蠊属Blaptica卵胎生昆虫(Wuetal., 2013)，主要分布于中美洲、南美洲，属于卫生害虫(Alameretal., 2014a; 2014b)。杜比亚蟑螂体内的蛋白质含量丰富，现多用于爬行动物和两栖动物的活体饲料，为开发潜力较大的资源昆虫之一 (Yietal., 2013；Tianetal., 2016)。杜比亚蟑螂产生的几丁质、抗菌肽和壳聚糖等已用于生产医药保健品、化妆品等(章敏等，2012)。随着昆虫体内微生物研究方法的不断改善，其体内大量的共生真菌不断被人们所认知(戈惠明等，2009；Teeetal., 2015)。昆虫体内微生物参与到昆虫生活的许多方面，包括昆虫的生理和进化，协助肠道消化食物，改善宿主营养，有利于种间种内通讯，抵御捕食者、病原菌以及寄生虫的入侵等(Crottietal., 2012；Engeletal., 2013)。昆虫共生真菌及其产生的次生代谢产物类型丰富、结构新颖、抗性较好，是目前国内外研究的重点(汪福源等，2017)。从棉蝗肠道菌Phomasp.中分离得到化合物epoxydon 6-methylsalicylateester，具有中等的免疫抑制活性和较强的除草活性(张应烙等，2010)；从菜粉蝶肠道中分离得到的共生真菌Alternariasp.，发酵培养后得到7种对酪氨酸激酶具有不同程度抑制活性的次生代谢产物(郭玲芝等，2014)。

目前关于蜚蠊科共生真菌的研究报道较少，从德国小蠊Blattellagermanica肠道和粪便中分离出22株具有抗真菌活性和产铁能力的菌株，表明肠道菌群对保护蟑螂免受真菌侵染和定植有重要作用(Zhangetal., 2018)。从美洲大蠊Periplanetaamericana体内分离出假丝酵母、曲霉和红曲霉等23种真菌(Kassirietal., 2018)，此外，美洲大蠊的甲醇提取物含有甾醇类和具有抗细菌活性的异黄酮类化合物(尹卫平等，2012)。然而尚未见杜比亚蟑螂共生真菌及其次生代谢产物的研究。杜比亚蟑螂体内是否存在共生真菌，共生真菌种类以及共生真菌次生代谢产物的生物活性等问题值得研究和探讨。本论文以杜比亚蟑螂为研究对象，分离并鉴定其中的共生真菌，通过发酵培养提取共生真菌的次生代谢产物，并测定其抗菌和抗氧化活性，以期为杜比亚蟑螂及其共生真菌的综合开发与利用提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

杜比亚蟑螂Blapticadubia于2016年11月30日购自青岛连万家杜比亚专卖店。

1.2 仪器与试剂

SW-CJ-2G型超净工作台(苏州净化设备有限公司)；LRH系列生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；ZF-2型三用紫外仪(上海安亭科学仪器厂)；HQ45恒温摇床(中国科学院武汉科学仪器厂)；BCD-280W医用冷藏箱(海尔生物医疗有限公司)；旋转蒸发仪OSB-2100(东京理化器械株式会社)；DSX-280KB30手提式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；Exceed-C超纯水机(成都唐氏康宁科技发展有限公司)；JA2003N分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；DIS-2012R全温振荡摇床(上海世平实验设备有限公司)；LC-16高效液相色谱(日本岛津)；Thermo VarioskanTMLUX 多功能酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)。

乙酸乙酯、无水乙醇、二氯甲烷等均为分析纯(天津富宇精细化工厂)；分析纯甲醇(天津富宇精细化工厂)；色谱纯甲醇(上海星可高纯溶剂有限公司)；升汞(广逸化工有限公司)；GF254薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)；噻唑蓝(MTT)生物显色剂(Amresco公司)；硫酸链霉素(美国Sigma公司，99%)。

1.3 共生真菌的分离和纯化

共生真菌的分离参照Shan等(2012)的方法。将活体杜比亚蟑螂用清水清洗20 min，晾干。先用75%乙醇处理30 s，再用0.2%氯化汞处理20 min，而后用无菌水冲洗3次，每次5 min，最后置于无菌滤纸上晾干。去除杜比亚蟑螂的翅、足和头胸部，将蟑螂的腹部剖开后放置在PDA培养基平板中(含500 μg/mL的硫酸链霉素)，在28℃恒温培养箱内暗培养。待共生真菌长出后，从每个菌落的边缘挑取少量菌丝接种到新的PDA培养基上，连续纯化多次，直至菌落形态均匀一致为止。将分离纯化得到的杜比亚蟑螂共生真菌依次编号为Bdf-1～Bdf-5。将纯化好的共生真菌接种到PDA斜面上，4℃保存，备用。共生真菌分离频率(CF)的计算公式如下：

1.4 共生真菌的鉴定

1.4.1共生真菌的形态学鉴定

将共生真菌菌株接种于PDA平板上，28℃恒温培养5～10 d，观察、记录菌落形态并拍照，并在光学显微镜下观察菌丝形态和产孢情况，记录菌丝有无隔膜以及孢子的大小等。

1.4.2共生真菌的分子生物学鉴定

参照宋慧云等(2018)的方法对分离到的共生真菌进行鉴定。将纯化后的菌株(在PDA平板上生长5 d)接种到PDB培养基中，于28℃ 150 rpm振荡培养6～7 d，减压抽滤后获得其菌丝。用液氮将菌丝充分研磨至粉末状，采用试剂盒法(上海生工DNA抽提取试剂盒)提取其DNA。使用真菌通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG-3′)扩增其ITS序列，PCR反应体系(50 μL)：2×TaqPCR Master Mix(含染料)25 μL，ITS4(10 μmol/L)1 μL，ITS5(10 μmol/L)1 μL，DNA模板(10 ng/μL)2 μL，双蒸水21 μL，混匀。扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min 20 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。所得序列使用DNAMAN软件进行互补拼接，将正向与反向引物互补序列两端加上引物序列拼接成完整序列，所得的rDNA-ITS序列提交到GenBank数据库，获得其登录号。

将扩增所得的rDNA-ITS序列在NCBI网站上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行Blast，在GenBank数据库中进行同源性检索，下载与其相似性较高的序列及其近似属的序列，通过MAFTT version 7处理后，使用MEGA 7.0.26软件采用最大似然法构建系统发育树，其中Bootstrap method中重复抽样次数设置500，模式为General Time Reversible Model。

1.5 共生真菌次生代谢产物的制备

采用PDB培养基对分离鉴定后的共生真菌进行发酵培养，通过减压抽滤分别得到菌丝和菌液。菌丝经乙酸乙酯冷浸提取3次，每次7 d，菌液直接采用乙酸乙酯萃取3次，分别将提取液和萃取液减压浓缩，得到菌丝和菌液次生代谢产物，4℃保存备用。

1.6 抗细菌活性的测定

采用薄层层析(TLC)-噻唑蓝(MTT)-生物自显影法测定共生真菌次生代谢产物对不同供试细菌的抑制活性(欧阳锦逵等，2017)。供试细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli，G-)、黄瓜角斑病菌(Pseudomonaslachrymans，G-)、番茄疮痂病菌(Xanthomonasvesicatoria，G-)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，G+)、青枯病菌(Ralstoniasolanacearum，G-)、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens，G-)和溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus，G+)。将提取物用丙酮溶解，在薄层层析板上用直径0.5 mm的毛细管点样，点样量为5 μL。采用二氯甲烷和甲醇的混合溶液作为展开剂进行薄层层析，浓度为0.2 mg/mL硫酸链霉素作为阳性对照。向灭菌的LB半固体培养基中加入菌液(45 mL LB + 5 mL菌液)，调其浓度约为108CFU/mL，振荡均匀。用喷样器将菌液均匀快速地喷洒到硅胶板上，待培养基冷却凝固后，将硅胶板置于培养皿中于4℃冰箱中放置4 h，以利于抗菌成分的扩散；再将硅胶板置于28℃下保湿培养，12 h后取出硅胶板，均匀喷洒0.5 mg/mL MTT，静待几分钟后观察实验结果。有抗菌活性成分处，供试细菌由于受到活性成分的抑制而出现抑菌斑；无抗菌活性成分处，供试细菌正常生长，喷洒MTT后显蓝紫色。通过抑菌斑的迁移率(即Rf值)来初步评价样品中抗菌化合物的极性，根据抑菌斑的大小和多少来初步评价活性化合物的抑菌活性和数量。Rf值计算公式如下：

1.7 抗氧化活性的测定

采用多孔板-DPPH显色法测定共生真菌次生代谢产物对DPPH的清除率，以IC50值来表示共生真菌次生代谢产物的抗氧化能力(Ouyangetal.，2018)。精密称取DPPH 20.0 mg溶于100 mL无水乙醇中，振荡摇匀，使其终浓度为0.2 mg/mL。阳性对照BHT和各提取物的初始浓度为10.0 mg/mL，而后用DMSO依次对半稀释成浓度为5 mg/mL～0.0390625 mg/mL的溶液。向96微孔板中加入80 μL浓度为0.2 mg/mL DPPH无水乙醇溶液，而后加入20 μL系列浓度的待测样品溶液或阳性对照溶液，震荡摇匀。在37℃下水浴30 min，517 nm下测定吸光值。以20 μL DMSO溶液代替样品溶液作为空白对照，每个处理3个重复，供试样品对DPPH清除率的有效中浓度(IC50)计算公式如下：

所得数据采用Excel软件进行作图分析，供试样品浓度取对数(X)，清除率换算成机率值(Y)，初步求得抗氧化活性的回归方程(Y=aX+b)和IC50值。

1.8 共生真菌次生代谢产物的高效液相分析

为进一步探究杜比亚蟑螂共生真菌次生代谢产物的情况，本研究采用高效液相对其次生代谢产物进行分析。将发酵得到的5株共生真菌菌丝和菌液提取物各10 mg，用1 mL色谱甲醇溶解后，再用0.22 μm有机滤膜过滤，将滤液转移到样品瓶中，待测。使用甲醇-水梯度洗脱，其色谱条件为：0～2 min使用20%甲醇等度洗脱；2～20 min，甲醇浓度由20%线性递增到100%；20～25 min，使用100%甲醇进行洗脱；25～30 min，使用20%甲醇对色谱柱进行平衡，紫外检测器设置为254 nm单通道采样。

2 结果与分析

2.1 共生真菌的分离和鉴定

从杜比亚蟑螂中总共分离得到13株共生真菌，通过菌落和显微形态观察，合并相同的菌株，最后得到5株形态各异的共生真菌，分别编号为Bdf-1～Bdf-5。其菌落和显微形态如图1所示。

光学显微镜下观察发现，分离到的所有菌株菌丝均为有隔菌丝，在正常培养条件下均有孢子产生。杜比亚蟑螂共生真菌形态学描述见表1。菌株Bdf-2、Bdf-3和Bdf-5均有曲霉属真菌典型的分生孢子头产生，但菌落形态却存在较大差异，因此采用分子生物学方法对筛选出的形态各异的共生真菌进行进一步的鉴定。

图1 杜比亚蟑螂共生真菌菌落形态及其显微结构Fig.1 The morphological characters of symbiotic fungi in Blaptica dubia

表1 杜比亚蟑螂共生真菌形态学描述

通过PCR扩增、测序后，将拼接完整的ITS序列提交至GenBank，获得其登录号，并构建系统发育树(图2)。结合菌落形态、显微观察以及构建的系统发育树，杜比亚蟑螂共生真菌的最终鉴定结果如表2所示。5株共生真菌主要分布于青霉属、曲霉属和聚孢霉属，其中曲霉属的种类最多(3株)，说明曲霉属为优势种群，其余两属各有1株。青霉属虽然只有1株Bdf-1，但其分离频率高达30.77%，仅次于曲霉属的Bdf-3(46.15%)。曲霉属和青霉属真菌虽多为腐生菌，但也常常作为昆虫的共生真菌被报道。中华剑角蝗肠道共生真菌草酸青霉Penicilliumoxalicum产生的次生代谢产物对人体多种癌细胞具有显著的生长抑制作用(喻梦岚等，2014；郑燕丽等，2014)。

2.2 共生真菌的抗细菌活性

采用TLC-MTT-生物自显影法测定了杜比亚蟑螂共生真菌菌液和菌丝提取物对不同供试细菌的抑制活性(表3)。结果表明，5种共生真菌菌液和菌丝提取物均表现出一定的抗菌活性，但同一提取物对不同供试细菌的抑制活性存在一定的差异。其中Bdf-1菌丝提取物对黄瓜角斑病菌未表现出抑制活性，而Bdf-3菌丝提取物对枯草芽孢杆菌未表现出抑制活性。所有菌株菌液提取物抑菌斑的Rf值范围明显大于菌丝提取物，说明菌液中含有更多的抗菌活性化合物。Rf值主要与化合物的极性有关，Rf值越小，化合物极性越大，Bdf-1、Bdf-3和Bdf-4菌液提取物Rf值在0.0～0.5之间均有分布，说明三株菌的菌液中具有抗菌活性的次生代谢产物其极性为中等偏大。Bdf-1和Bdf-3菌丝提取物Rf值主要分布在0.35～0.60之间，说明两菌的菌丝中具有抗菌活性的物质主要为中等极性的次生代谢产物，而Bdf-4菌丝提取物Rf值主要分布在0.0～0.12之间，说明抗菌活性物质的极性偏大。Bdf-2和Bdf-5菌液提取物抑菌斑的Rf值范围完全覆盖菌丝提取物，说明菌液提取物中具有抑菌活性的次生代谢产物更为丰富。从抑菌斑的最大直径来看，Bdf-4和Bdf-5菌液提取物对所有供试细菌的抑菌斑最大直径均超过10 mm，而菌丝提取物要明显弱于菌液，抑菌斑最大直径一般在5～10 mm之间，其中Bdf-4菌丝提取物对黄瓜角斑病菌和大肠杆菌抑菌斑的最大直径要大于10 mm。除黄瓜角斑病菌外，Bdf-2菌液提取物对其他供试细菌的抑菌斑的最大直径也超过10 mm，且菌丝提取物弱于菌液提取物。Bdf-1和Bdf-3对不同供试细菌的抑制活性要弱于Bdf-2、Bdf-4和Bdf-5，但也表现一定的抗菌活性，抑菌斑的最大直径多集中于5～10 mm之间。

表2 杜比亚蟑螂共生真菌鉴定结果

图2 依据杜比亚蟑螂共生真菌rDNA-ITS序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of symbiotic fungi isolated from Blaptica dubia based on the rDNA-ITS sequence

综上所述，菌株Bdf-2、Bdf-4和Bdf-5表现出较好的抗菌活性，且菌液提取物的抗菌活性要强于菌丝，说明杜比亚蟑螂共生真菌产生的活性次生代谢产物主要分泌到胞外，为极性偏大的化合物，这与抑菌斑的Rf值偏小的结果相一致。

2.3 共生真菌的抗氧化活性

采用DPPH法测定了5株杜比亚蟑螂共生真菌菌液和菌丝提取物的抗氧化活性(表4)。结果表明，Bdf-4和Bdf-5菌液和菌丝提取物在供试浓度下均未表现出任何抗氧化活性。Bdf-1，Bdf-2和Bdf-3的菌液提取物均表现出明显的抗氧化活性，IC50值分别为0.26±0.01 mg/mL、2.20±0.99 mg/mL和0.75±0.16 mg/mL；而菌丝提取物的IC50值均大于5 mg/mL。说明Bdf-1，Bdf-2和Bdf-3中具有抗氧化活性的次生代谢产物主要分布于菌液中。

表4 杜比亚蟑螂共生真菌不同提取物对DPPH的清除力

注：“B”表示菌液提取物； “M”表示菌丝提取物。
Note: “B” was the crude extract from broth; “M” was the crude extract from mycelia.

图3 杜比亚蟑螂共生真菌的菌丝和菌液不同提取物HPLC色谱图Fig. 3 HPLC chromatograms for different crude extracts of symbiotic fungi isolated from Blaptica dubia

2.4 共生真菌次生代谢产物的高效液相分析

采用HPLC对分离得到的5株杜比亚蟑螂共生真菌菌丝和菌液提取物进行分析，其色谱图如下所示(图3)。HPLC分析结果表明，在波长为254 nm的检测条件下，5株共生真菌都含有一定量的次生代谢产物，其中菌株Bdf-1、Bdf-3以及Bdf-5菌液次生代谢产物的数量要高于其菌丝，且主要差异均表现在化合物极性偏大的区域，即保留时间在20 min之前的区域，通过前面的研究发现，菌株Bdf-1和Bdf-3菌液提取物表现出较好的抗氧化活性，而Bdf-5菌液提取物表现出较好的抗菌活性，是否与这些成分有关还有待于进一步研究。此外，菌株Bdf-2和Bdf-4菌液中的化合物种类与菌丝差异不大，但其紫外吸收明显弱于菌丝，说明次生代谢产物主要分布于菌丝中，而菌株Bdf-2和Bdf-4菌丝提取物的抗菌活性要弱于菌液，说明254 nm下含量较高的化合物其抗菌活性并不强。本实验所得到的高效液相色谱图，可以为杜比亚蟑螂共生真菌活性次生代谢产物的分离和纯化提供参考。

3 结论与讨论

本研究采用组织块分离法从杜比亚蟑螂中分离鉴定出5株共生真菌，分属于青霉属、曲霉属和聚孢霉属，其中青霉属和曲霉属菌株为优势菌株，可能与杜比亚蟑螂生活的环境有关。青霉属和曲霉属真菌作为常见的昆虫和植物共生菌以及腐生菌，也能够产生多种活性次生代谢产物，且生活环境不同，共生真菌所产生的次生代谢产物和生物活性也大不相同。从南海红树林中分离得到的鲜红青霉，能够产生对葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶具有不同程度抑制活性的化合物(Huangetal., 2011)。Aspergillusnomius是巴西坚果中黄曲霉毒素的重要生产者(Olsenetal., 2008)。从吉兰泰盐田沉积物中分离出Penicilliumcitrinum，并从该菌的发酵物中得到两个桔霉素二聚体化合物，对DPPH自由基表现出一定的清除活性(Luetal., 2008)。本研究所采用的供试材料为人工饲养的杜比亚蟑螂，生活环境相对单一，且并不是所有的共生真菌均能在人工培养基上生长，所以分离到的共生真菌种类和数量偏少。本论文分别提取共生真菌菌丝与菌液的次生代谢产物，进而比较共生真菌胞内(菌丝)和胞外(菌液)次生代谢产物在抗细菌和抗氧化活性方面的差异。其中菌液提取物的抗细菌和抗氧化活性要强于其菌丝提取物，菌株Bdf-2、Bdf-4和Bdf-5菌液提取物表现出较强的抑菌活性，而Bdf-1，Bdf-2和Bdf-3的菌液提取物均表现出较好的抗氧化活性。其中Bdf-4鉴定为Clonostachyssp.，Roberti等(2008)发现从感染镰刀菌的小麦冠中分离出的粉红螺旋聚孢霉Clonostachysrosea，可以抑制谷物的种传镰刀菌病害。杜比亚蟑螂共生真菌次生代谢产物是否具有抗真菌、抗肿瘤和酶抑制活性还有待于进一步研究，此外，这些次生代谢产物对杜比亚蟑螂的抗病性和环境适应性等的影响也是接下来研究的重点。本研究为进一步分离杜比亚蟑螂共生真菌中的抗菌和抗氧化活性成分奠定了基础，为杜比亚蟑螂及其共生真菌的综合开发与利用提供了新的思路。