刘丽莉 代晓凝 杨晓盼 刘 宇 张晓莉 魏小花

(1. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2. 食品加工与安全国家级教学示范中心，河南 洛阳 471023)

鸡蛋清蛋白质的氨基酸组成与人体的十分接近，是理想的蛋白质来源，在食品加工领域有着广泛应用。蛋清粉作为食品行业中鲜蛋的热门替代品，具有优良的凝胶性、起泡性、乳化性等功能特性，且运输方便、保藏性能高，弥补了加工过程中鲜蛋供应不足的问题。加工过程中的工艺操作将不可避免地影响蛋清粉的结构进而影响其功能特性[1]。

目前，关于鲜蛋清干燥方面的研究多集中于喷雾干燥、冷冻干燥及热风干燥。研究表明，真空冷冻干燥全蛋粉的溶解度、起泡性及乳化性明显优于喷雾干燥全蛋粉[2]，但干燥用间长、能耗大、效益低；喷雾干燥蛋清粉凝胶硬度较大，随进口温度的升高逐渐增强[3]。赵金红等[4]研究表明喷雾干燥鸡蛋粉的吸附等温线呈Ⅱ形，为蛋制品的最适干燥或冷冻加工条件提供理论依据，然而喷雾干燥蛋清粉蛋白变性严重，易吸湿粘结。Katekhong等[5]研究发现干燥方法和储存条件对蛋清粉颜色与胶凝性质的影响显著，热风干燥的蛋清粉在高温下储存，会引起样品颜色和蛋白质构象的变化，从而影响其凝胶特性，且样品需二次破碎，溶解度低。当前鲜蛋粉工业化加工方式主要是喷雾干燥、真空冷冻干燥，但存在加工温度过高影响产品质量及时间长、能耗大、效益低的壁垒，探究新的鲜蛋清干燥方式势在必行。

喷雾冷冻干燥(Spray freeze drying，SFD)作为近几年新兴的干燥技术，综合了喷雾干燥和真空冷冻干燥的优点，降低能耗符合低碳要求。SFD所产样品呈颗粒状，流动性好，几乎不改变产品的生物活性[6]，应用范围更广。研究[7-8]表明喷雾冷冻干燥对葛仙米藻胆蛋白抗氧化特性的影响更小，在产品结构、质量、挥发物和生物活性化合物的保留方面比常用干燥方式效果更好。Parthasarathi等[9]研究表明相比于喷雾干燥微胶囊，喷雾冷冻干燥微胶囊呈多孔结构，具有良好的溶解性和高生物利用率。目前还未见将喷雾冷冻干燥应用于蛋清粉的报道。试验拟以喷雾冷冻干燥法制备的鸡蛋清为研究对象，并将其与喷雾干燥蛋清粉进行对比，深入探讨喷雾冷冻干燥对鸡蛋清蛋白特性和结构的影响，为蛋清粉的深加工提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

鲜鸡蛋：河南省洛阳市大张超市；

溴化钾：分析纯，天津市光复经济化工研究所；

DTNB：分析纯，洛阳试剂厂。

1.2 仪器与设备

喷雾干燥机：YC-015型，上海雅程仪器设备有限公司；

喷雾冷冻干燥机：YC-3000实验型，上海雅程仪器设备有限公司；

食品物性分析仪：TA.XT Epress Enhanced型，英国SMS公司；

核磁共振成像分析仪：Ml20.015V-1-I型，上海纽迈电子科技有限公司；

紫外分光光度仪：UV2600型，日本日立公司；

差示扫描量热仪：Q200型，瑞士Mettler-Toledo公司；

电子扫描显微镜：TM3030Plus型，日本岛津公司；

傅里叶红外光谱仪：VERTEX70型，德国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 鸡蛋清粉的制备

(1) 喷雾干燥蛋清粉的制备：鲜鸡蛋刷洗后带壳消毒，晾蛋后分离出蛋清，采用500 r/min的转速搅拌15 min，滤出系带等杂质后25 ℃自然发酵48 h脱糖，经45 ℃巴氏杀菌30 min后，进行喷雾干燥(进口温度170 ℃，出风温度80 ℃)，过筛得到喷雾干燥蛋清粉。

(2) 喷雾冷冻干燥蛋清粉的制备(图1为喷雾冷冻干燥装置)：鲜鸡蛋刷洗带壳消毒，晾蛋后分离出蛋清，采用500 r/min的转速搅拌15 min，滤出系带等杂质后25 ℃自然发酵48 h脱糖，经45 ℃巴氏杀菌30 min后，进行喷雾冷冻干燥(冷浸温度-80 ℃、进料量15 mL/min、加热温度60 ℃)，过筛得到喷雾冷冻干燥蛋清粉。

1. 真空泵 2. 冷却液进口 3. 冷凝器 4. 冷却液出口 5. 二流体喷雾器 6. 喷雾冷冻干燥室 7. 热转换器 8. 冷却液出口 9. 冷却液进口 10. 风机 11. 空压机图1 喷雾冷冻干燥装置Figure 1 Spray freeze drying device

1.3.2 蛋清粉结构特性测定

(1) 巯基含量：根据Liu等[10]的试验方法测定鸡蛋清粉凝胶样品的总巯基及表面巯基含量。

(2) 傅里叶红外光谱(FT-IR)分析：将蛋清粉样品与溴化钾混匀压片，并用FT-IR仪进行扫描。用Peak Fit v4.12软件对红外光谱的酰胺Ⅰ带进行去卷积处理，再进行二阶导数拟合。

(3) 差示扫描热量(DSC)分析：使用DSC法测定干燥处理后的蛋清蛋白变性温度。氮气流速设定20 mL/min，在20～150 ℃范围内扫描，升温速率设定10 ℃/min 得到曲线。

(4) 凝胶电泳(SDS-PAGE)分析：蛋清蛋白配制成4%的溶液，分离胶浓度15%，浓缩胶5%；上样量为20 μL，电泳开始时用90 V电压，溴酚蓝浓缩到浓缩胶底部时加大至110 V，结束后染色2 h，并脱色至透明。

(5) 扫描电子显微镜(SEM)分析：取微量蛋清粉于导电胶上，并粘于样品台，喷金后在扫描电子显微镜下观察样品的微观结构。

1.3.3 蛋清粉功能特性的测定

(1) 溶解度、乳化特性、起泡特性的测定：参照文献[11]。

(2) 凝胶特性：用蒸馏水将蛋清粉稀释成质量浓度10%的溶液，搅匀后，倒入25 mL的烧杯中于80 ℃加热45 min，取出后在4 ℃的冰箱中冷藏过夜。凝胶取出后在室温下放置20 min，采用TPA模式，探头P/0.5，测前5 mm/s，测中2 mm/s，测后2 mm/s，触发力3 g。

(3) 水分子弛豫特性(LF-NMR)：称取凝胶1 g放入核磁管中，利用多脉冲回波序列测量样品的自旋—自旋弛豫时间：测量温度32 ℃，主频22 MHz，偏移频率303.886 kHz，累加次数4次，采样间隔时间1 500 s。

1.3.4 考马斯亮蓝标准曲线的绘制 以牛血清蛋白为标准蛋白，配制浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL 的溶液，各取0.1 mL，分别向其中加入5 mL考马斯亮蓝试剂，混匀，10 min后在595 nm处测得吸光值，并以蛋白含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。如图2所示，考马斯亮蓝标准曲线的回归方程为y=0.043 79+1.831 1x，R2=0.998 4。依据标准曲线计算出样品蛋白质含量，该方程线性较好，可用于下一步试验。

图2 考马斯亮蓝标准曲线Figure 2 The standard curve of coomassie blue

1.4 数据处理

试验所涉及到的测定结果均做3次重复，试验数据用Origin 9.0软件作图，用SPSS软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 蛋清粉蛋白结构分析

2.1.1 蛋清粉巯基含量分析 巯基含量影响蛋白质的功能特性；在凝胶的形成过程中，巯基可通过氧化形成二硫键，对凝胶结构和硬度产生影响[12]。图3为干燥对蛋清粉巯基含量的影响。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

图3表明：与SD蛋清粉样品相比，SFD蛋清粉蛋白的总巯基和表面巯基含量均发生了显著变化(P<0.05)。SFD比SD蛋清粉的总巯基含量高4.45%(P<0.05)；SFD比SD蛋清粉的表面巯基含量低42.40%(P<0.05)；说明干燥方式不同对蛋清粉巯基含量的影响也不同。干燥时冷冻或高温都可能会破坏蛋白分子构象(分子伸展、氢键破坏等)，导致巯基和二硫键暴露，发生巯基氧化和二硫键交换反应[13]。另外SFD蛋清粉总巯基含量比SD高而表面巯基含量比SD低，是因为SD为瞬时高温干燥，相对于SFD的低温干燥，蛋白质变性程度更大；也说明了喷雾干燥时蛋清粉中蛋白质部分亚基解离，二硫键发生交换反应，结构展开内部巯基暴露；暴露于表面的巯基数增多，分子间和分子内的相互作用增强，有利于蛋白凝胶性能的提高[14]。

2.1.2 DSC分析 应用DSC法测定干燥方式对蛋清粉蛋白变性的影响，主要通过峰值温度(Tp)和热焓值(ΔH)两个指标进行判定。由表1可知，两种干燥方式对蛋清粉蛋白质影响显著。SFD蛋清粉的Tp值比SD的低15.70 ℃，而热焓值又比SD的高89.60 J/g，且差异均显著(P<0.05)，Kato等[15]的研究发现，蛋清焓值的降低，表明蛋白结构展开，有利于凝胶特性的改善。出现上述结果的原因可能是喷雾干燥时蛋清粉蛋白质受高温影响结构被部分破坏，埋藏在内部的疏水基团在此过程中部分外露，蛋白质亚基组分解离之后又重新折叠形成具有更高Tp更稳定的热聚集体[16]，且疏水性氨基酸所占比例越高蛋白质的稳定性也就越好。

表1干燥后鸡蛋清粉的热变性温度及热焓值†
Table 1 Heat denaturation temperature and enthalpy value of egg white powder after drying

干燥方式峰值温度/℃热焓值/(J·g-1)SFD94.66±0.02b218.68±0.50aSD110.36±0.05a128.88±0.41b

† 同列肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.1.3 FT-IR分析 蛋白质的结构特性与蛋白质的功能特性密切相关；3 600～3 300 cm-1处的峰强通常可以表示蛋白分子氢键(内部和外部)及O—H、N—H键的伸缩振动强度[17]。由图4可知，在3 600～3 300 cm-1处，两种蛋清粉的峰强有明显差别；表明干燥方式会影响并改变蛋清粉蛋白的水合能力；这可能是蛋白质分子中N—H伸缩振动与氢键形成了缔合体所致。1 700～1 600 cm-1的波长范围为酰胺I带，对于研究蛋白质的二级结构最有价值，与氢键作用力紧密相关。SD蛋清粉在酰胺I带处的峰位相比SFD的1 651.44 cm-1红移到1 650.48 cm-1处，且峰强更大，峰宽也更宽，说明喷雾干燥能使N—H与C═O形成的氢键总量增加。如表2所示，SD蛋清粉蛋白二级结构中α-螺旋结构比例较SFD降低了17.68%。α-螺旋时蛋清蛋白二级结构中主要的有序结构，通过分子内氢键维持，约占总结构的40%[18]，凝胶硬度与α-螺旋含量之间呈负相关。SD蛋清粉中β-折叠含量比SFD的降低了21.96%；其原因可能是喷雾干燥温度较高致使氢键断裂，蛋白质分子空间构象改变，β-折叠或无规则卷曲的多肽链结构发生了180°的反转，转变为β-转角结构。

2.1.4 SDS-PAGE分析 由图5可知，两种蛋清粉的条带区别较为明显，且主要条带为卵清蛋白(45 kDa)、卵转铁蛋白(76～80 kDa)、溶菌酶(14～22 kDa)。相对于SFD蛋清粉蛋白进样口几乎无样品残留，SD蛋清粉蛋白进样口样品残留明显。喷雾干燥蛋清粉时，高进口温度相比低进口温度出现大分子电泳条，表明喷雾干燥能使蛋白质发生变性聚集。

2.1.5 SEM分析 由图6可知，SFD蛋清粉主要由大颗粒组成，具有较大的孔隙度，且整个颗粒具有相互连通的孔隙网络结构，比表面积大，复水性好；SD蛋清粉的组成颗粒较小，只有一个孔洞，孔隙度和比表面积小；且颗粒表面形成一种光滑、高抗湿的薄膜，因此，不易溶于水[19]。尺寸和形态的差异受干燥方式的影响较大。在SFD过程中，液滴被冻结，颗粒中的水形成冰晶并通过升华作用被移除，因此，形成的颗粒内部具有相互连接的多孔结构。然而，在SD过程中，液体被喷嘴喷入干燥室并受热风影响，通过蒸发快速脱去水分；蒸发脱水作用使液滴收缩，外表面凝固，形成光滑的表面结构，溶解度降低进而导致其乳化性降低。

图4 蛋清粉红外光谱图Figure 4 Infrared spectrum of egg white powder

表2 蛋清粉酰胺I带二级结构组成比例 Table 2 Egg white powder amide I belt secondary structure composition ratio %

Marker. 标准蛋白 1. SFD蛋清粉蛋白 2. SD蛋清粉蛋白

图6 蛋清粉颗粒的微观结构图Figure 6 Microstructure of egg white powder particles (×1 000)

2.2 蛋清粉功能特性分析

2.2.1 蛋清粉溶解性分析 由图7可知，在pH 2～9条件下两种蛋粉的溶解度均呈现出先降低后升高的趋势，在pH 3时达到最低。这是因为蛋清粉的的等电点在pH 3 左右，而蛋白在等电点时，分子间静电排斥作用最低，蛋白质分子静电荷为零，蛋白质聚集、沉降，导致鸡蛋清粉溶解度最低。总体来讲，pH在2～9时，SFD样品的溶解度普遍高于SD样品，结合上述SEM图分析表明，SFD样品颗粒疏松多孔，且孔径相对较大，使其复水能力增加，溶解度增高；另外可能是喷雾干燥是直接将蛋清液雾化再干燥，产生的蛋清粉颗粒较小，孔隙小，表面会形成一个光滑、抗湿性的薄膜，复水性差，易结块，导致其溶解性降低[20]。而喷雾冷冻干燥制得的蛋清粉颗粒较大，能较为快速的分散于水中。

2.2.2 蛋清粉功能特性分析 由表3可知，干燥方式不同会导致分子结构发生变化，SFD蛋清粉不论在乳化性还是乳化稳定性方面都有明显优势(P<0.05)；同时可能是蛋白质的乳化性与其溶解度密切相关，溶解度较大，乳化性也相对较高[21]，因此，SFD的溶解度更大，使其乳化特性也更好。结合前面红外对结构的分析表明SFD粉的α-螺旋和β-折叠结构比例大，分子结构更有序。潘成磊等[22]研究发现β-折叠含量的增加能够提高蛋白乳化液的乳化稳定性，这也是使其乳化特性得到改善的另一原因；SFD蛋清粉和SD蛋清粉两种样品起泡性和泡沫稳定性差异不显著(P>0.05)。表明SD蛋清粉在搅打时能更快的吸附至空气—水界面，降低界面张力。高溶解度的蛋白虽然易形成高弹性多层膜，但坚硬的薄膜会阻止气泡的黏聚，导致起泡性降低，而不溶解的蛋白质能增加表面黏度，阻止泡沫的破裂，增大其泡沫稳定性[23]。这可能也是SD蛋清粉具有较好起泡性的原因之一。两种样品间凝胶硬度差异显著(P<0.05)，SFD蛋清粉凝胶硬度比SD的低42.37%；结合前期DSC和SDS-PAGE对二者结构的分析表明SD蛋清粉蛋白变性温度更高，部分分子发生聚集，说明其变性程度更大，有利于凝胶性的改善；SD蛋清粉蛋白凝胶硬度更大，可能是SD温度更高，蛋白质变性程度较SFD大，分子间发生聚集反应有利于网络结构的形成，从而提高了蛋清粉凝胶硬度[24]，这一结果与前期巯基含量的分析相一致。

图7 干燥对蛋清粉蛋白溶解性的影响Figure 7 Effect of drying on the solubility of egg white powder protein

表3 干燥对蛋清蛋白的乳化特性、起泡特性和凝胶硬度的影响†Table 3 Effect of drying on the emulsifying properties, foaming properties and gel hardness of egg white protein

† 同列肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.2.3 蛋清粉凝胶水分弛豫特性分析 水分子与其他组分的结合程度不同，导致水的氢原子在磁场中衰减速率不同，横向弛豫时间(T2)可以分析样品中水分流动性[25]。图8和表4分别为蛋清粉凝胶T2横向弛豫时间反演谱和蛋清粉凝胶的T2弛豫时间及峰面积比例。

由图8可知，根据蛋清粉凝胶横向弛豫时间的分布，可将样品中的水分分布分为三部分：结合水(0～10 ms)，束缚水(10～100 ms)及自由水(100～1 000 ms)。由表4可知，相比SFD凝胶，SD可使凝胶T21、T22及T23均明显降低，说明SFD蛋清粉凝胶中的水与大分子的结合更加松散，可能是SFD干燥样品温度低，蛋白质几乎不变性，活性基团包埋于分子内，形成的网状结构，孔隙大，导致凝胶与水的结合能力下降[26]。另外，SD凝胶T21的比例比SFD的增加了0.94%，表明样品中有更多的水分子与蛋白质大分子结合，可能是SD蛋清粉蛋白中极性基团和带电基团的增多，并与水分子以偶极—离子和偶极—偶极的形式结合[27]；然而，蛋清粉凝胶中T21所占比例很小，不能只通过PT21的大小判断凝胶的保水性。SD的PT22值比SFD的76.70%增加了18.42%，表明更多的水被束缚在凝胶网络里，此现象与离心法测定的凝胶失水率相反，表明蛋清粉凝胶中大部分水以束缚水形式存在。Pearce等[28]认为束缚水比例的升高表明肌原纤维外部水比例的升高，肉的保水性提高，与试验结果类似。SD蛋清粉凝胶PT23值从SFD的4.06%降低到0.84%，表明更多的自由水转变为不易流动水留在凝胶网络内。

图8 蛋清粉凝胶T2横向弛豫时间反演谱Figure 8 Inverse spectrum of transverse relaxation time of egg white powder gel T2

表4 蛋清粉凝胶的T2弛豫时间及峰面积比例†Table 4 T2 relaxation time and peak area ratio of egg white powder gel

†T21、T22、T23分别为结合水、束缚水和自由水的弛豫时间；PT21、PT22、PT23分别为结合水、束缚水和自由水的比例。

3 结论

与喷雾干燥蛋清粉相比，喷雾冷冻干燥蛋清粉结构与功能特性发生很大变化。喷雾冷冻干燥蛋清粉蛋白在分子结构上更加有序，蛋白质发生聚集程度小，颗粒孔隙率大且具有相互连通的网络结构，在溶解度和乳化特性方面更具有优势；喷雾干燥蛋清粉蛋白变性和聚集程度大，使其凝胶硬度更大(P<0.05)，保水性好，但二者起泡性无明显差别。因此，试验将喷雾冷冻干燥方式应用于鸡蛋清的干燥，为其在鸡蛋清粉的应用提供了技术支持，同时对打破蛋清粉加工行业的壁垒具有重要意义。但目前试验的重点仍在对结构表征的论述上，后续将研究喷雾冷冻干燥对蛋清中蛋白组学的影响，探讨蛋白组学与蛋清粉功能特性之间的相关性。