雷 璇，郑明学，郭钰珏，白 瑞，张 黎，张雪松，康慧鑫，李瑞琪，殷莉阳，杨洪静，王 辰，郭露露

(山西农业大学动物医学学院，山西 太谷 030801)

鸡球虫病会给世界禽类产业造成巨大的经济损失[1]。目前控制鸡球虫病的方法是使用抗球虫药物和球虫病活疫苗，但抗球虫药物导致了很多问题的出现[2-3]，且强毒株球虫病活疫苗会使鸡只出现较大的损伤，影响其生长性能。鸡球虫病三价四株活疫苗采用早熟弱毒株，致病性弱，对鸡的生长性能影响小且含2种巨型艾美耳虫珠，具有较广的抗虫范围。为保证鸡球虫病三价四株活疫苗的免疫效果，本实验室对该疫苗进行了最小免疫剂量试验、最小首免日龄试验、最小二免间隔期试验、免疫产生期和持续期试验以及网上平养和地面平养试验。

1 材料与方法

1.1 疫苗和虫株 鸡球虫病三价四株活疫苗(柔嫩艾美耳球虫PTSX株+巨型艾美耳球虫PMSX株+巨型艾美耳球虫PMSD株+堆型艾美耳球虫PASX株)(每毫升疫苗液中含PTSX3.0×105个孢子化卵囊、PMSX3.0×104个孢子化卵囊、PMSD3.0×104个孢子化卵囊、PASX1.2×105个孢子化卵囊)，以上虫株均由山西农业大学兽医病理实验室保存与提供。

1.2 实验动物 SPF雏鸡由北京Merial SPF种蛋孵化而来。

1.3 最小免疫剂量试验 将网上平养的4日龄SPF雏鸡随机分为12组，10只/组，分别为一次免疫攻毒组(T11～T14)、二次免疫组(T21～T24)、攻毒对照组(C1、C2)和空白对照组(C01、C02)。使用不同剂量的鸡球虫病三价四株活疫苗分别于4日龄对T11～T14和T21～T24组首免，14日龄对T21～T24组二免，各组免疫剂量见表1。T11～T14和C1组于一免14 d、T21～T24和C2组于二免14 d空腹称重后攻击检验用混合强毒(PTSX4.0×104、PASX20.0×104、PMSX15.0×104、PMSD15.0×104个孢子化卵囊/只)；C01(18日龄空腹称重)和C02(28日龄空腹称重)不接种不攻毒。攻毒后连续7 d观察鸡只临床状况(精神状态、食欲和死亡情况等)并记录。攻毒第7天末剖检所有鸡只，观察记录十二指肠、小肠中段和盲肠的病理变化，并进行病变记分，计算平均值。选择能达到免疫效力标准的最低剂量作为最小免疫剂量。

1.4 最小首免日龄试验 将网上平养的4日龄SPF鸡随机分为9个组，每组10只，包括1个空白对照组(C0)、4个不免疫攻毒组(C1～C4)和4个免疫攻毒组(T1～T4)。免疫攻毒组以最小免疫剂量，分别于2、3、4日龄和5日龄进行一次免疫，一免第10天以2倍最小免疫剂量进行二次免疫，免疫后第14天同1.3项攻检验强毒，攻毒后观察和测定指标除1.3项外，同时计算每组鸡只的平均增重、相对增重以及死亡率，选择能达到免疫效力标准的最小免疫日龄作为最小首免日龄。

1.5 最小二免间隔期测定 将网上平养的SPF鸡随机分为11个组，每组10只，分别为1个空白对照组(C0)、5个不免疫攻毒组(C1～C5)和5个免疫攻毒组(T1～T5)。免疫攻毒组以最小免疫剂量分别于4日龄进行一次免疫，一次免疫后在第7、8、9、10天和第11天以2倍最小免疫剂量进行二免，免疫后第14天同1.3项攻检验强毒。攻毒观察和测定指标同1.4项，选择能达到免疫效力标准的最低二免间隔作为最小二免间隔期。

1.6 免疫产生期和持续期试验 将网上平养的SPF鸡随机分为13个组，每组10只，分别为1个空白对照组(C0)、6个不免疫攻毒组(C1～C6)和6个免疫攻毒组(T1～T6)，T1～T6组以1倍和2倍最小免疫剂量分别于4日龄和14日龄进行一次、二次免疫，二免后第6、10、14、28、42、56天攻混合强毒(剂量同一免)。所有鸡只在饲养过程中按常规进行鸡新城疫、禽流感、传染性法氏囊、传染性支气管炎免疫接种。攻毒观察指标和方法同1.4项，选择以免疫后免疫力最早能达到效力检验标准的时间为免疫产生期；以免疫后免疫力可保持达到效力检验标准的最长时间为免疫持续期。

1.7 网上平养和地面平养对免疫效果的影响 SPF鸡随机分为4个组，每组10只，分别为空白对照组(C0)、不免疫攻毒组(C1)、网上平养免疫攻毒组(T1)和地面平养免疫攻毒组(T2)，免疫攻毒组以推荐免疫剂量1羽份和2羽份分别于4日龄、14日龄进行一次和二次免疫，二次免疫后第14天同1.3项攻检验强毒。攻毒后进行观察，指标和方法同1.4项，判断该疫苗是否适合于网上和地面平养。

1.8 检测指标及判定标准

1.8.1 检测指标

(1)增重：

平均增重=(每组总终体重-每组总初体重)/每组总鸡只数

相对增重率(RWG)=(试验组的平均增重/空白对照组的平均增重)×100%

(2)死亡率：

死亡率=(每组死亡鸡只数/每组总鸡只数)×100%

(3)肠道病变记分:参考Johnson和Reid法[4]和《兽用生物制品质量标准汇编》(2008版)[5]分别在第7天对十二指肠、空肠和盲肠进行病变记分。

1.8.2 免疫效果判定标准 参照《兽用生物制品质量标准汇编》(2008版)和佛山正典的鸡球虫病三价活疫苗的标准[6]，结合本实验室早熟株和检验用强毒株的特性，将本疫苗效力检验的标准定为：攻毒对照组，鸡的十二指肠、盲肠的平均病变记分≥3.00，空肠平均病变记分≥2.00，死亡率为40.0%～50.0%；免疫攻毒组，鸡的十二指肠、空肠中段和盲肠的平均病变记分应≤1.50，其中至少8只雏鸡3个 肠段的病变记分应≤1.0，死亡率≤10.0%。

2 结果

2.1 最小免疫剂量 一次免疫后，各组鸡均未见明显异常，随免疫剂量增加，免疫组鸡平均增重、相对增重率逐渐降低，免疫组攻毒前的相对增重率在80%左右，见表2；攻毒后除一免(T11、T12)两组和攻毒对照组(C1组)死亡率为10.0%、10.0%和40.0%外，其余各组均无死亡。攻毒后，免疫攻毒组各肠道平均病变记分随免疫剂量增加逐渐降低，免疫组肠道平均病变记分极显著低于攻毒对照组(P<0.01)。当鸡球虫病三价四株活疫苗一次免疫剂量≥7 200个孢子化卵囊/只时，免疫攻毒组至少9只鸡各肠道病变记分均≤1.0，达到良好免疫效果，见表3。

二次免疫试验在免疫后未见明显异常，攻毒后除C2组死亡率为40.0%外，其余各组均无死亡。攻毒后，随免疫剂量增加，肠道平均病变记分逐渐降低；除T21组外，其余各免疫组肠道平均病变记分均≤1.0，极显著低于攻毒对照组(P<0.01)。当鸡球虫病三价四株活疫苗一免/二免剂量分别≥1 600和3 200个孢子化卵囊/只时，免疫攻毒组至少9只鸡各肠道病变记分均≤1.0，死亡率≤10.0%，达到了良好免疫效果，免疫组攻毒前的相对增重率均高于90%，见表2和表3。

表2 一次免疫与二次免疫接种对鸡增重的影响Table 2 Effects of first and second immunization on average weight gain in chickens

表3 一次免疫与二次免疫攻毒组的肠道病变情况Table 3 Intestinal pathological changes in groups of first and second immunization

2.2 最小首免日龄 免疫鸡只在免疫期内粪便未见异常也没有出现死亡。攻毒后，随着首免日龄的增大RWG也相对提高。首免日龄≥4日龄(T3和T4组)免疫攻毒组鸡的十二指肠、空肠中段和盲肠的平均病变记分均≤1.50，均显著低于(P<0.05)不免疫攻毒组鸡(C1～C4组)。其中至少9只雏鸡3个肠段的病变记分均≤1.0，死亡率≤10.0%，符合效力检验标准，见表4。

表4 最小首免日龄测定结果Table 4 Results of minimum first immunization ages test

2.3 最小二免间隔 RWG随着二免间隔的增大而提高。所有免疫攻毒组均符合效力检验标准即免疫攻毒组鸡的十二指肠、空肠中段和盲肠的平均病变记分均≤1.50，且至少8只雏鸡3个肠段的病变记分≤1.0，死亡率≤10.0%，见表5。

表5 最小二免间隔测定结果Table 5 Results of minimum second immunization interval test

2.4 免疫产生期和持续期测定 雏鸡在一次免疫后第10～14天(T1～T6组)产生了部分的免疫力，但不符合效力检验标准。二次免疫后≥6 d攻毒组(T1～T6组)鸡的十二指肠、空肠中段和盲肠的平均病变记分均≤1.50，其中至少8只雏鸡3个肠段的病变记分均≤1.0，死亡率≤10.0%，均符合免疫攻毒组的效力检验标准，见表6。

表6 免疫产生期和持续期测定结果Table 6 Results of producing immunity time and immunity duration test

2.5 网上与地面平养的效果测定 网上平养免疫攻毒组(T1)和地面平养免疫攻毒组(T2)鸡只平均增重和RWG无显著差异(P>0.05)。且T1和T2组鸡均没有出现死亡，鸡的十二指肠、空肠中段和盲肠的平均病变记分均≤1.50，其中至少8只雏鸡3个肠段的病变记分均≤1.0，符合效力检验标准，见表7。

表7 网上平养与地面平养对疫苗免疫的影响Table 7 The influence of rearingon floorand in battery on the vaccine immunity

3 讨论

鸡球虫病活疫苗的免疫效力在一定剂量范围内会随着免疫剂量的增大而提高[7]。免疫接种球虫卵囊后机体对球虫的免疫力随着时间延长而降低，但也会随着再次接种而增强，且在二次免疫中一免提供的免疫力更强，也能够保持更长时间，因此对于增强免疫力反复接种球虫卵囊是一个较好的方法[8]。本试验结果显示，随接种剂量的增高，鸡只的免疫保护力也增高。当一次免疫时剂量≥7 200个 孢子化卵囊/只和二次免疫时一免/二免剂量分别≥1 600和3 200个孢子化卵囊/只时均符合免疫标准，在免疫效果合格的情况下，二次免疫接种剂量小于一次免疫。当PASX、PMSX、PMSD以及PTSX的首次免疫剂量分别≥400、100、100、1 000个孢子化卵囊/只，二次免疫剂量分别≥800、200、200、2 000个 孢子化卵囊/只时，可达到良好免疫效果，符合本疫苗效力检验标准。因此，在进行该疫苗的免疫时，PASX、PMSX、PMSD以及PTSX的一次免疫最小剂量分别为400、100、100、1 000个孢子化卵囊/只，二次免疫最小剂量分别为800、200、200、2 000个孢子化卵囊/只。

在日龄较小时鸡免疫系统发育不成熟，不能产生对球虫的有效免疫反应，从而导致鸡只不能产生足够的免疫力，但免疫日龄过大，在球虫病多发期尚不能产生有效的保护性免疫反应，容易导致球虫病的暴发[9-10]。因此，需要选择雏鸡接种后能够产生良好抵抗力的最小日龄。本试验选择2～5日龄为首免范围，结果显示，随着首免日龄的增大，免疫力也会随之提高。当首免日龄≥4日龄时，免疫效果符合本疫苗效力检验标准，因此选取4日龄为最小首免日龄。在研究鸡球虫早熟株的首免日龄时，王丽[11]和吕强华[12]发现雏鸡的首免日龄在4～6日龄范围内，均可以获得良好免疫力，与本试验结果相似。

一免后，体内抗体仍可以在一段时间内提供足够的免疫力[8]。而体内抗体持续性决定二免间隔时间，为了使机体内的抗体水平迅速提高，则需要在最适时间进行二次免疫，从而提高免疫力。王丽[11]和颜静蕊[13]的研究结果显示，E.acervulina和E.necatrix的早熟株二免间隔为7～11 d时，雏鸡能够获得足够的保护力。本试验选择7～11 d为二免间隔来测定该疫苗的最小二免间隔，结果表明，所有组别均符合疫苗效力检验标准，也就说明雏鸡在7～11 d的二免间隔时间内，均可获得良好的免疫力。因此，7 d为本疫苗的最小二免间隔。

本疫苗按照最小免疫剂量和最小首免日龄来进行免疫，二免在第6～56天攻毒，结果显示雏鸡均产生了良好的免疫效果，所有观测指标均符合疫苗效力检验标准。因此，本疫苗的免疫产生期为二免后的第6天，持续期至少可达到第56天，表明该疫苗可以保护商品白羽肉鸡的整个生长期(45 d左右)。

试验结果显示，网上平养和地面平养对该球虫疫苗免疫雏鸡的生长性能的影响无显著差异，对免疫效力也无显著影响，证明鸡球虫病三价四株活疫苗可用于网上平养和地面平养2种饲养方式的鸡群。