曾刊 李鑫 汪成林 杨静 叶玲

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科 成都 610041

肿瘤骨转移是肿瘤晚期的表现之一，肿瘤发生骨转移往往预示着病情恶化，与患者的生存率有较大的关系，给患者及家属带来极大的身体和经济负担[1]。因此，对肿瘤骨转移过程的研究分析成为了当前研究热点。肿瘤骨转移是肿瘤转移中较为频繁的一种转移方式，其特殊之处在于转移灶是代谢较为活跃的骨组织。肿瘤细胞进入骨组织，成为浸润肿瘤细胞（disseminated tumor cell，DTC）后，从其定植到扩增，再到明显临床症状，往往经历数年甚至数十年的休眠，最终才会成为肿瘤转移灶[2-3]。该定植、休眠及活化过程中，肿瘤细胞与骨组织微环境中细胞的密切交流，是导致肿瘤骨转移休眠的重要影响因素。

骨微环境中的细胞丰富，最具代表的细胞有成骨细胞、破骨细胞、骨髓基质细胞、免疫细胞、血管内皮细胞等。成骨细胞与破骨细胞是肿瘤骨转移过程中引起溶骨性、成骨性或混合性骨转移的关键因素[4]；而骨髓基质细胞在肿瘤骨转移初期对肿瘤转移有一定抑制作用[5]；同时，免疫细胞的免疫监视、免疫杀伤、配合破骨细胞形成转移前病灶作用[6]以及血管内皮细胞的骨营养供给作用[7]，在骨转移过程中也起重要作用。肿瘤骨转移过程中，肿瘤细胞除自身调节外，还与骨微环境中的细胞发生作用，本文对这一作用及机制进行综述。

1 肿瘤细胞的自我调节

肿瘤细胞浸入骨微环境中成为DTC，对自身的调节是决定其是否能在骨微环境中长期潜伏、休眠的重要条件。肿瘤细胞这种自我调节是其对抗自身免疫和化学药物的重要机制[8]。肿瘤细胞初期定植时，往往伴随肿瘤细胞表面的受体纤连蛋白（fibronectin，FN）的低表达，黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）-Ras-细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信号通路减弱；尿激酶受体调节的α5β1整合素激活反应减少，而β1整合素激活过程受损会致使P38-丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路激活[9-11]。高ERK/P38比例是细胞有丝分裂的前提，所以早期肿瘤细胞高P38通路活性与低ERK通路活性致使肿瘤细胞增殖减弱，导致肿瘤细胞持续性休眠[12]。另外，当肿瘤细胞遭遇苛刻条件，如：缺氧、低血糖、高酸环境等，肿瘤细胞能改变蛋白质在内质网中的修饰，这种应激耐受称为“折叠蛋白反应”（unfolded protein response，UPR）[13]。内质网产生应激后，增强P38通路，诱导内质网产生应激标志物葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78），促使肿瘤细胞休眠。肿瘤细胞除了抑制自身增殖外，亦通过自噬作用，控制自己的数量[14]。肿瘤细胞自噬主要和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）有关，其中较为重要的是mTORC1抑制，mTORC1主要调控自噬相关UNC-51样激酶1（UNC-51-like kinase，ULK）和自噬相关蛋白（autophagy-related protein，ATG）基因[15]。例如：当细胞营养缺失时，mTORC1激酶活性降低，ULK及ATG诱导肿瘤细胞自噬，从而使肿瘤细胞进入休眠。另外，肿瘤细胞亦会分泌一些因子，对其骨转移过程产生重要作用。其中比较有趣的是dickkopf-1（DKK1），DKK1是无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族（wingless-type mice mammary tumour virus integrationsite family，WNT）信号通路的抑制剂，WNT信号通路参与了肿瘤细胞的增殖生长，部分研究表明DKK1升高，能促进肿瘤休眠[16]。与此相反的是，有部分实验证明高水平DKK1会诱导乳腺癌肿瘤骨转移溶骨性病灶的发生，这可能与DKK1调节成骨细胞有关。这些结果表明DKK1除了调节肿瘤细胞休眠以外，还可能通过调节肿瘤细胞微环境，促进肿瘤从休眠中活化[17]。肿瘤细胞自身调节是肿瘤细胞周期静止的主要方式，在研究肿瘤骨转移微环境影响转移因素时，应当注重骨微环境与肿瘤细胞内在因素的联系。

2 成骨细胞与肿瘤细胞

肿瘤细胞与成骨细胞的相互作用主要体现在成骨细胞促进肿瘤细胞黏附和定植方面。随着对肿瘤骨转移的不断研究和发展，越来越多的实验[18]提出了“转移前病灶”这一概念，即肿瘤细胞到达靶器官后，成为DTC，进入休眠期，短期内不再增殖活化，甚至表达为Ki67阴性细胞。而在肿瘤骨转移过程中，DTC的定植与成骨细胞息息相关。因此，有学者[19-20]提出将肿瘤细胞骨转移最初定植的位置称为“成骨细胞龛”。成骨细胞之所以与肿瘤细胞早期定植及休眠有重要关系，其中一组关键分子是基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）及半胱氨酸-X-半胱氨酸趋化因子受体4（cysteine-X-chemokine receptor，CXCR4）[21-23]。SDF-1又称CXCL12，由成骨细胞高表达，而肿瘤细胞高表达CXCR4，意味着肿瘤细胞对成骨细胞有高度的趋化性，肿瘤细胞到达成骨细胞龛之后，激活CXCL12/CXCR4通路，增强肿瘤增殖及侵袭能力[24]。此外，有研究[18]表明，早期骨转移肿瘤细胞激活过程与成骨细胞细胞膜上的N-钙黏蛋白（N-cadherin，N-cad）和肿瘤细胞细胞膜上的E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）有关，成骨细胞上的N-cad与肿瘤细胞上的E-cad结合后，能激活肿瘤细胞内的mTOR信号通路，促进休眠的肿瘤细胞活化增殖。参与该过程的还包括CD151、Ca+[25-26]等。除此之外，成骨细胞也参与肿瘤细胞休眠激活后的增殖过程，主要表现为成骨细胞参与肿瘤细胞与骨微环境的“恶性循环”，表现为骨微环境破坏与肿瘤细胞增殖通过释放各种生长因子相互促进[27-28]。其中较为重要的包括白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）、细胞核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）等。IL-6作为“恶性循环”中的重要参与因子[29-30]，其来源主要包括肿瘤细胞自分泌、骨转移破骨过程产生、成骨细胞分泌等。IL-6参与“恶性循环”过程，主要体现为：一方面，IL-6直接作用于肿瘤细胞，其促进上皮间充质化的作用，能加重肿瘤细胞恶性化；另一方面，IL-6作用于成骨细胞，能诱导成骨细胞表达RANKL，通过骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、RANKL、细胞核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK），即OPG-RANKL-RANK信号轴，直接作用于破骨细胞，促进肿瘤细胞破骨进程，打破骨改建平衡，致使肿瘤组织水平上活化，诱导肿瘤进展。RANKL作为成骨细胞表达分泌的重要因子，存在于成骨细胞表面或者由成骨细胞分泌入骨微环境，主要起调节骨改建过程的作用。而有研究[31]表明，细胞膜上的RANKL除了起到调节骨改建过程，还有诱导肿瘤细胞进入成骨细胞龛的作用，因为部分肿瘤细胞也表达RANK。另外，现研究阶段已证实，TGF-β信号通路是肿瘤细胞与成骨细胞交流的重要通路，主要过程也是通过TGF-β诱导肿瘤细胞表达PTHrP[32]，从而诱使成骨细胞加强RANKL的分泌，导致上述过程的进一步加强。目前的研究表明，成骨细胞在肿瘤骨转移早期主要通过各类受体辅助肿瘤细胞定植，肿瘤骨转移后期则主要参与“恶性循环”促进肿瘤增殖。

3 破骨细胞与肿瘤细胞

破骨细胞是肿瘤细胞骨转移过程中的重要促进因子。在肿瘤骨转移早期，血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1）与整合素家族是介导肿瘤细胞与破骨细胞联系的重要分子[33]。肿瘤细胞高表达VCAM1与破骨细胞表达的α4β1整合素相互作用，能募集破骨前体细胞，启动破骨进程，最终诱导肿瘤骨转移的溶骨性临床表现。一旦破骨进程启动，骨微环境中的“恶性循环”也随之启动。破骨细胞是“恶性循环”中的重要效应细胞，具体体现在其直接打破原有骨改建平衡，启动溶骨效应，使无症状的肿瘤休眠期进入溶骨性骨转移临床表现期。肿瘤细胞分泌的PTHrP和Notch信号通路配体Jagged1[34]是参与破骨恶性循环的重要因子。PTHrP与成骨细胞分泌RANKL，启动经典OPG-RANKL-RANK信号轴促进破骨进程有关；而Jagged却直接作用于破骨细胞，加速破骨过程，推进肿瘤骨转移过程。其实，肿瘤骨转移过程，也离不开破骨的重要因子，其中最具代表的是金属基质蛋白酶（metal matrix proteinase，MMP）家族[35]。研究[36]表明，在乳腺癌小鼠模型中，具有血栓反应蛋白基的分解素（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1，ADAMTS1）和MMP1协调旁分泌系统，调节骨微环境，进而导致破骨形成，促使肿瘤细胞进一步活化。另外，肿瘤细胞自身也能同过分泌乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）促进破骨过程[37]，辅助自身进一步转移。而抑制破骨进程的药物，如蛋白酶抑制剂组织抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinase 2，TIMP2）、乳腺丝抑蛋白（maspin）却能抑制肿瘤细胞活化[38]，延长肿瘤休眠期。从目前的研究进展来看，破骨细胞在肿瘤骨转移及骨改建过程中均起到重要作用，为重要的效应细胞，特异性抑制肿瘤破骨进程将极大地提高肿瘤骨转移患者的生存质量。

4 骨髓基质细胞与肿瘤细胞

肿瘤细胞浸润入骨髓中后，骨髓基质细胞对肿瘤细胞休眠过程有重要影响。骨髓基质细胞中生长停滞特异性蛋白6（growth arrest-specific 6，GAS6），作为受体酪氨酸激酶亚家族成员MER、TYRO3及AXL的配体，调节造血干细胞的休眠过程[39]。当DTC侵入骨微环境后，GAS6有类似的调节作用。GAS6与肿瘤沉默和肿瘤特异性转移部位有关[40]。与后肢骨相比，前肢骨GAS6表达更高，其转移率也偏低。而肿瘤细胞在GAS6-/-来源的椎体中比GAS6+/+中生长得更好。成骨细胞表达的膜联蛋白Ⅱ（Annexin Ⅱ）亦能通过GAS6调节肿瘤细胞休眠，其与肿瘤细胞上的Annexin ⅡR结合启动肿瘤细胞中的AXL、TYRO3、MER的转录过程，这些恰好是GAS6发挥诱导肿瘤休眠的重要受体，因此能诱导肿瘤细胞进入休眠[41]。骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein 7，BMP7）是由骨髓基质细胞分泌的分泌蛋白，能与肿瘤细胞上的BMPR2结合，抑制ERK信号通路和激活P38，从而诱导DTC的休眠，因此破坏这一过程能诱导肿瘤逃离休眠[42]。另外有些研究[6]发现，肿瘤细胞与骨髓基质细胞通过缝隙连接和外泌体进行微小RNA（micro RNA，miRNA）传递，以促进肿瘤细胞休眠，这些miRNA诱导细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、细胞周期蛋白D3（cyclin D3）、细胞周期蛋白C（cyclin C）降低及诱导细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）、p21增加，从而达到细胞周期阻滞，抑制肿瘤细胞增殖，进入休眠。微环境调节细胞休眠的过程与mTOR信号通路有关[43]。前列腺癌与ST2细胞共培养显著抑制了肿瘤细胞增长。肿瘤细胞与ST2细胞共培养增加了肿瘤细胞TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK-1）的表达。TBK-1与mTOR共定位，而TBK-1与mTOR呈负调控关系，因此TBK-1增强能抑制mTOR通路，mTOR信号通路抑制致使肿瘤细胞休眠。目前的研究表明，骨髓基质细胞对肿瘤细胞整体起抑制作用，而要激活休眠的肿瘤细胞，往往要突破这些抑制过程，这也是研究者设计抗肿瘤细胞药物，抑制肿瘤转移生长的重要靶点。

5 免疫细胞与肿瘤细胞

肿瘤细胞作为体内特殊抗原与自身免疫细胞有重要关系。肿瘤细胞到达骨微环境后，会促进骨微环境中CD56+CD8+ T细胞与记忆CD4+ T细胞生长[44]。CD8+ T细胞与肿瘤转移潜伏期有明显的关系，CD8+ T细胞作为适应性免疫的重要细胞能直接杀伤肿瘤细胞。而研究[45]表明浸润树突状浆细胞（plasmacytoid dendritic cell，PDC）持续性释放Th2信号，抑制CD8+ T细胞，而促进调节性T细胞（T regulatory cell，Treg）成熟，促休眠肿瘤生长。而PDC减少，会减慢肿瘤细胞骨转移活化进程。CD8+ T细胞和CD4+ T细胞耗尽，会诱导肿瘤脱离休眠及凋亡和诱导肿瘤细胞Ki67的上升，使其增殖活化能力上升。免疫细胞通过改变骨改建过程，亦参与肿瘤细胞休眠激活过程。CD169+巨噬细胞参与肿瘤骨转移成骨细胞的成骨作用；CD169-巨噬细胞直接影响肿瘤细胞的增长。在免疫健全的小鼠前列腺癌成骨性骨转移模型中，破坏其巨噬细胞，当巨噬细胞中CD169+细胞破坏后，肿瘤骨转移部位编织骨形成障碍。而整体敲除CD169-及CD169+巨噬细胞后，对肿瘤细胞的免疫监视减少，肿瘤细胞逃离免疫系统与肿瘤细胞的平衡，使肿瘤组织逃离休眠，引起肿瘤增加[46]。另外，巨噬细胞亦通过RANKL/OPG、SDF-1、IL联系成骨细胞、破骨细胞等共同作用，促进肿瘤增殖[47]。肿瘤骨转移与免疫细胞随着肿瘤免疫治疗的兴起，也逐渐得到重视。然而，目前骨转移动物模型大多都是免疫缺陷的动物模型，继续关注免疫细胞与肿瘤骨转移的关系应得到研究者的重视。

6 血管内皮细胞与肿瘤细胞

肿瘤细胞到达骨微环境后，新生血管是营养供给的重要来源。研究[7]表明，乳腺癌细胞转移最开始是滞留在微血管的内皮细胞上，在脉管系统未完全形成之前，可以检测到血小板反应蛋白（thrombospondin，TSP）及血管舒张素的升高。TSP能诱导肿瘤细胞休眠，在脉管系统不成熟的转移前病变中，肿瘤转移潜伏期能大于90 d。而在新生血管周围，内皮细胞能分泌TGF-β1和骨膜蛋白（periostin，POSTN），从而诱导肿瘤继续增殖[7]。血管内皮生长因子α（vascular endothelial growth factor α，VEGFα）作为促血管生成的重要因子，在促进肿瘤细胞休眠活化过程中起到举足轻重的作用。通过应用异丙肾上腺素刺激β2受体，刺激交感神经，会导致血管密度增高和骨中VEGFα表达升高，辅助肿瘤细胞定植，诱导肿瘤细胞休眠活化，这也是慢性压力促进肿瘤复发转移的重要原因[48]。营养供给是细胞生长的重要资源，对骨转移营养供给渠道的研究不仅对肿瘤骨转移有重大意义，对肿瘤转移乃至肿瘤原位生长都有深远意义，对骨转移过程血管内皮细胞的研究必不可少。

7 小结与展望

肿瘤的防治一直是研究热点，但是研究发现单从肿瘤细胞出发，单纯抑制肿瘤细胞，取得效果并不显著。随着研究深入，肿瘤进展的过程逐渐清晰，肿瘤休眠的理论被提出，现如今，更多的研究者把研究目光转向了宿主自身，关注宿主自身微环境，希望通过提高患者自身免疫力或者改善肿瘤生存微环境，达到抑制肿瘤进展、诱导肿瘤细胞休眠的目的。通过整理肿瘤细胞与骨微环境细胞的相互作用，阐述了肿瘤骨转移骨微环境与肿瘤休眠进展的诸多关系，为肿瘤治疗提供了靶点。相信随着研究的进一步深入，肿瘤患者能得到更好的治疗。