孙 艳 综述,多丽波审校

(哈尔滨医科大学附属第二医院检验科，黑龙江哈尔滨 150086)

肠杆菌科细菌是社区和医院感染中的常见病原菌之一，20世纪80年代以来，碳青霉烯类抗菌药物一直被认为是对抗产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶肠杆菌感染的最有效手段，但近年来临床上抗菌药物的过度使用导致耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)的产生，并在全球范围内呈广泛流行的趋势。2017年中国细菌耐药监测数据显示，肠杆菌科细菌对3种碳青霉烯类药物的耐药率已接近10.0%，而肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率已上升至20.9%和24.0%[1]。克隆传播及通过质粒介导的传播使CRE感染发病率持续升高，进而使临床上应用抗感染药物治疗的困难逐年上升。CRE耐药机制主要包括以下几个方面：(1)产碳青霉烯酶；(2)外膜蛋白的缺失或合并产AmpC酶或ESBLs；(3)青霉素结合蛋白对碳青霉烯类药物亲和力下降；(4)药物外排泵高度表达。研究CRE的耐药机制及实验室早期检测对临床上治疗其感染具有重要指导意义。

1 CRE定义

2015年美国疾病控制中心(CDC)对CRE定义为对任意一种碳青霉烯类抗菌药物耐药，或产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌。此外，对亚胺培南天然非敏感的细菌，如摩根摩根菌、变形杆菌、普罗威登斯菌，需对其他碳青霉烯类抗菌药物耐药。

2 CRE耐药机制

2.1产碳青霉烯酶 产碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药的最重要机制。根据Ambler分类，碳青霉烯酶主要分为A、B和D类。其中A类碳青霉烯酶和D类碳青霉烯酶属丝氨酸酶，主要通过水解丝氨酸活性位点使药物失活；B类碳青霉烯酶又叫金属酶，其活性中心需结合金属锌离子才能发挥催化活性。

2.1.1A类碳青霉烯酶 至今发现肠杆菌科细菌产生的A类碳青霉烯酶包括KPC、GES、IMI、SME及SFC等，最常见的是KPC，其他酶在我国相关报道尚少，在其他国家肠杆菌科细菌中有检出或流行。A类碳青霉烯酶可水解几乎所有β-内酰胺类药物，包括碳青霉烯类药物、青霉素类药物、氨曲南，其活性可被含酶抑制剂部分抑制，被硼酸完全抑制，不能被乙二胺四乙酸抑制。

肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPCs)是A类碳青霉烯酶中最重要的酶，由质粒编码，既可通过克隆菌株垂直传播，也可通过遗传性移动元件如转座子、质粒等水平传播，KPCs可水解所有β-内酰胺类药物，产KPCs型CRE仅对替加环素、多黏菌素及氨基糖苷类抗菌药物敏感。现已发现22种KPCs[2]，各种KPCs显示出高度同源性，并通过非同义突变而不同，KPC-2和KPC-3在全球范围内最常见，我国华东地区KPC-2检出率较高，而在我国台湾KPC-2及KPC-17检出率较高。

含有不同质粒，但具有相同遗传结构的不同克隆Tn4401被认为是blaKPC在世界范围内广泛传播的起源。有研究发现，blaKPC-2位于Tn4401转座子上，其上游为Tn4401-tnpR、Tn4401-tnpA、ISKpn7序列,下游为ISKpn6序列[3]。与上述研究不同，2014年，LUO等[4]通过对从北京某医院获得的12株CRE携带的blaKPC-2遗传背景研究发现，blaKPC-2位于基于转座子Tn3和部分Tn4401区段的整合结构上，其中ISKpn8代替了ISKpn7。

2.1.2B类碳青霉烯酶 B类碳青霉烯酶为金属酶，主要包括5种：VIM、IMP、NDM、GIM和SPM，最常见的是IMP、NDM、VIM。B类碳青霉烯酶能水解青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类药物，不能水解氨曲南，可被乙二胺四乙酸抑制而不受含酶抑制剂的影响。

2010年，在印度发现的NDM-1引起广泛关注，产NDM-1细菌对除替加环素与多黏菌素之外的抗菌药物均耐药，部分细菌甚至表现为泛耐药。GRUBER等[5]通过建立体内感染产NDM-1黏质沙雷菌小鼠模型，证明产NDM-1菌不仅广泛耐药，其半数致死量比非产NDM-1菌高出许多。NDM-1主要流行于印度、巴基斯坦等南亚国家，跨境旅行是NDM-1在国际间传播的重要原因，而国内报道的NDM-1案例多无国外旅居史，因此，我国被认为是继印第安次大陆和巴尔干半岛之后的第三大NDM传播源。目前，已发现24种NDM，在肠杆菌科细菌中检出21种，主要由肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌产生。与NDM-1相比，各亚型通过单个或多个氨基酸的替换而不同，进而酶稳定性和活性也不同，NDM-4、NDM-5及NDM-7的水解活性强于NDM-1[6]。blaNDM-1位于转座子Tn125上两个插入序列ISAba125之间，Tn125能促进blaNDM-1表达而增强菌株对碳青霉烯类药物的水解活性，blaNDM-1下游存在bleMBL基因，能够稳定NDM-1基因，其他变异型中也存在两种序列，表明遗传环境并未发生变化。

VIM是金属酶中水解碳青霉烯类药物能力最强的酶，2003年，MIRIAGOU等[7]从希腊1例患者尿液标本中分离的大肠埃希菌检出VIM-1，随后，VIM在意大利、法国和俄罗斯等欧洲国家均有检出，主要由肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌产生，blaVIM常定位于Ⅰ类整合子。目前，发现至少46种VIM，VIM-2在全球最常见，2013年，我国WEI等[8]首次从芜湖一家医院分离的弗氏柠檬酸杆菌中检出VIM-4。

IMP-1首次发现于日本黏质沙雷菌的整合子上，之后日本广泛传播产IMP-1型CRE。目前至少检出52种IMP，主要分布在日本、巴西等国家，国内IMP-4和IMP-8较常见，且相继在上海、湖北、广东和台湾等地有检出。

2.1.3D类碳青霉烯酶 D类碳青霉烯酶又称苯唑西林酶(OXA)，对青霉素类药物水解作用强而水解碳青霉烯类药物弱，不能水解超广谱头孢菌素类药物，不被克拉维酸和乙二胺四乙酸抑制，常合并其他耐药机制而增强菌株耐药性：如合并其他产碳青霉烯酶表达，外膜蛋白改变，由作为启动子的IS元件介导的转录增加，基因拷贝数增加，以及外排泵作用。

目前，发现D类碳青霉烯酶400余种，肠杆菌科细菌最常见为OXA-48及亚型。OXA-48最初于2004年在土耳其分离的CRKP中被报道[9]，随后在包括黎巴嫩、突尼斯、埃及及摩洛哥等许多环地中海国家相继被分离并报道。2013年美国首次报道了两株携带OXA-48的CRKP之后，在美国OXA-48检出率逐年上升[10]。国内产OXA-48肠杆菌科细菌的传播和暴发报道较少，目前，在我国台湾、北京及浙江等地有报道，2015年，MA等[11]首次报道了分离自我国台湾地区的4株携带OXA-48的CRKP。2016年，GUO等[12]报道了产OXA-48肺炎克雷伯菌在北京一家医院呼吸科的暴发。

blaOXA-48携带于60×103大小的InCl/M型接合质粒(JN626286)的Tn1999复合转座子上两个插入序列IS1999之间，其下游是可编码调节蛋白的lysR基因。意大利学者GIANI等[13]通过对大肠埃希菌携带的blaOXA-48基因结构分析，发现转座子Tn1999的变异亚型Tn1999.2(JN714122)于blaOXA-48上游插入了IS1R元件，而Tn1999.3(HE617182)则在blaOXA-48上下游均有IS1R元件插入，IS1R可充分激活blaOXA-48，使blaOXA-48过度表达。

除OXA-48还发现多种亚型，最常见的是OXA-181，其次包括OXA-162、-204、-232、-244、-245、-370、-436、-438和-484，以及不水解或弱水解碳青霉烯类药物的OXA-163、-247和-405。

2.2外膜蛋白的缺失或合并产AmpC酶或ESBLs 细菌耐药机制之一是产生外膜屏障，即通过改变膜孔蛋白结构使其与抗菌药物的结合降低。2012年，FINDLAY等[14]对1株产CTX-M-15肺炎克雷伯菌进行研究，通过十二烷基硫酸钠-脉冲场凝胶电泳(SDS-PFGE)发现该菌缺乏OmpK35及OmpK36，且显示对美罗培南耐药，最小抑菌浓度(MIC)值为8 μmol/L。2013年，我国学者SHI等[15]报道了产DHA-1型AmpC酶合并OmpK36蛋白缺失的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药，但该菌不产碳青霉烯酶。以上研究表明，外膜蛋白缺失或合并产AmpC酶或ESBLs可介导肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物的耐药。

2.3青霉素结合蛋白(PBP)对碳青霉烯类药物亲和力下降 碳青霉烯类药物可与细菌内膜表面的PBP结合，如PBP2和PBP3，破坏细胞壁合成，使细菌溶解。2013年，有学者通过将大肠埃希菌的MutS及toiC基因敲除，构建了1株PBP2高突变率，且无外排泵活性的大肠埃希菌(ΔmutSΔtolC)，发现PBP2不同位置的突变可导致菌株对不同类型的碳青霉烯类药物耐药[16]。另有研究发现，编码PBP2和PBP3的基因mrdA和基因fstⅠ的突变可分别导致PBP2和PBP3对美罗培南和厄他培南的亲和力下降，进而增强菌株对碳青霉烯类药物的耐药性[17]。

2.4药物外排泵的高度表达 外排泵过度表达与CRE的产生密切相关。我国台湾YANG等[18]曾报道，通过抑制外排泵AcrAB-TolC的活性，可使阴沟肠杆菌对厄他培南敏感性增加。巴西ROSA等[19]从耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌中检出AcrAR基因，而在耐碳青霉烯类产气肠杆菌未检出该基因，但通过加入泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)，证明外排泵活性存在，表明存在其他未知的外排泵。

3 CRE的实验室检测

由CRE引起的感染流行是全球健康问题，早期检测CRE对指导临床抗菌治疗及控制感染具有重要意义。目前，可用于碳青霉烯酶的检测方法主要包括表型检测、分子技术及免疫层析法。

3.1表型检测方法

3.1.1改良霍奇试验(MHT)及相关试验 将指示菌与待测菌共同孵育，结果指示菌在待测菌接种线与抑菌环相交处出现增强生长，即判断为MHT阳性。MHT检测A类碳青霉烯酶和D类碳青霉烯类酶的灵敏度及特异度均超过90%，但检测NDM的灵敏度低于50%。2016年PASTERAN等[20]在此基础上进行改良，通过加入非离子表面活性剂Triton X-100(可释放固定于膜上的脂蛋白-NDM)，对145株产酶株和40株非产酶株进行研究，检测NDM的灵敏度高达90%。但若存在其他耐药机制(如产ESBLs或产AmpC酶联合膜孔蛋白缺失)，MHT会出现假阳性，TAKAYAMA等[21]发现通过加入氯唑西林可消除假阳性。MHT所用试剂价格便宜，操作简便，2010年美国和临床实验室标准化协会(CLSI)推荐MHT为CRE的表型确证试验，但其耗时长，难以解释某些结果，不能区分酶类型，2018年已从CLSI M100-S28文件中删除。

3.1.2Carba NP(CNP)试验及相关试验 CNP试验原理是碳青霉烯酶水解β-内酰胺酶，使pH下降，指示剂酚红由红色变为黄色。其对A类碳青霉烯酶及B类碳青霉烯酶检测的灵敏度及特异度高达100.0%和94.4%，但对OXA-48的检测灵敏度低于75.0%。随后，研究者对CNP试验进行系列改进，联合他唑巴坦及乙二胺四乙酸开发的CNP Ⅱ试验可区分产碳青霉烯酶类型，且灵敏度及特异度均为100.0%[22]。改良的BYG Carba试验通过检测电化学信号判断结果，使结果更具有客观性，且检测OXA-48的灵敏度高达93.2%[23]。CNP试验快速、准确，2015年CLSI M100-S25文件推荐其为检测CRE的表型确证试验，用于流行病学和医院感染的监控。但CNP试验操作繁杂，需特殊试剂，不适合在常规实验室开展。

3.1.3碳青霉烯灭活试验(CIM)及相关试验 CIM首次由VAN DER ZWALUW等[24]报道，其原理是将浸泡过待测菌液的美罗培南纸片与标准菌共同培养，通过抑菌环大小来判定产酶与否，且该研究报道检测CRE的结果与PCR一致。随后,改良碳青霉烯类失活法(mCIM)试验出现，用营养肉汤代替水制备菌悬液，并延长孵育时间，检测CRE灵敏度更高。eCIM加入金属酶抑制剂乙二胺四乙酸，其与mCIM联合应用可初步区分丝氨酸酶与金属酶，2018年CLSI推荐二者联合使用作为鉴定产金属β-内酰胺酶(MBL)肠杆菌科细菌的方法。CIM操作简单，价格低廉，试剂易获得，目前已在微生物实验室开展应用。

3.1.4流式细胞术(FC) FC是一种快速、准确分析细胞结构及其功能参数的高通量技术，近年来，FC被应用于CRE的检测。FC原理是药物作用于细菌，细胞膜通透性改变，利用荧光染料染色，通过FC测得荧光强度的变化而反映药物的抗菌活性。2016年，SILVA等[25]通过加入一种细胞膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料DiBAC4(3)，并结合不同产碳青霉烯酶抑制剂，建立了一种基于FC可区分不同类型产碳青霉烯酶的表型检测方法，其检测CRE灵敏度及特异度均为100.0%。FC具有可定量分析、简便、耗时短等优点，但其所需设备昂贵，未在常规实验室开展。

3.1.5基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS) 近年来，MALDI-TOF-MS广泛应用于检测细菌耐药性，其原理是将待检菌与抗菌药物共同孵育，通过MALDI-TOF-MS检测抗菌药物水解或脱羧产物相对于其原始相对分子质量的变化，判断是否产生水解该抗菌药物的酶。2015年，LASSERRE等[26]以亚胺培南作为反应底物，以亚胺培南与其产物峰面积的比值定义产酶株，检测结果灵敏度为99.0%，特异度为100.0%。由于OXA类酶水解活性弱，采用MALDI-TOF-MS检测OXA类酶的灵敏度仅为76.0%，PAPAGIANNITSIS等[27]加入NH4HCO3，将反应液pH调至7.0，使MALDI-TOF-MS检测OXA-48的灵敏度达98.0%。MALDI-TOF-MS是一种快速、低成本、高通量的CRE检测方法，但其只能检测产酶CRE，且质谱仪价格昂贵，方法尚未标准化。

3.2分子检测方法 上述表型检测方法均不能确定CHLBs基因型，结果仍需分子检测技术确证基因型。传统PCR实验耗时长、效率低，且产物易污染，基于PCR，临床上开发了更为快速、高效、准确的分子检测方法。

3.2.1环介导等温扩增法(LAMP) LAMP检测原理为针对靶基因上的6个区域设计4条引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件下扩增，通过观察白色沉淀判断靶基因的存在。CHENG等[28]利用Bst聚合酶扩增基因，以SYBR为指示剂检测CHLBs基因(NDM、KPC、IMP及VIM)，结果与传统PCR完全一致。基于LAMP的试剂盒也相继开发，eazyplexw®SuperBug CRE系统有很高的通用性和准确性，可快速检测含有各种CHLBs耐药决定簇的菌株，该系统可检测的基因型包括VIM(1-37)、NDM(1-7)、KPC(2-15)、OXA-48家族(OXA-48、-162、-204和-244)、CTX-M-1及CTX-M-9 ESBL家族[29]。

3.2.2二代测序(NGS) NGS即高通量测序，是一种全基因组测序，具有高输出量和高解析度的特性，可提供丰富的遗传学信息，KHONG等[30]利用NGS对33株CRE测序，发现一种新型NDM质粒-pSg1-NDM，表明NGS可检出突变或新型基因型。NGS还可检测整合子和转座子等，发现其他耐药机制如外膜蛋白缺失，外排泵过度表达等。NGS可同时完成菌株流行病学和耐药机制的研究，对院内感染控制提供指导，但NGS成本高，需专业技术及设备，未能得到广泛应用。

3.3免疫学方法 最近发展起来的一种抗体介导的检测产碳青霉烯酶的免疫分析方法，利用CHLBs免疫小鼠获得单克隆抗体，进而通过抗原抗体特异反应检测待测菌，基于此原理开发的试剂盒Carba5可同时检测5种产碳青霉烯酶，包括：NDM-1(-4、-5、-6、-7、-9)、KPC-2(-3)、IMP-1(-8、-11)、OXA-48(-162、-181、-204、-232、-244、-517、-519、-535)及VIM-1(-2、-4、-19)，特异度和灵敏度均为100.0%[31]。Carba5可直接检测单个菌落、尿液标本或血培养标本，检测下限为106CFU/mL，快速(15 min)，易于实施，可在常规实验室中进行，但此方法只能检测产酶CRE。

4 结 语

近几十年来，CRE在世界范围内广泛传播，对人类健康构成巨大威胁。质粒介导的碳青霉烯酶基因的水平传播是CRE流行激增的主要原因，目前常见的产碳青霉烯酶为KPC、VIM、NDM、IMP和OXA家族，国内以KPC、NDM及IMP为主，OXA-48报道尚少，但也有零星报道及暴发流行[11-12]，应引起重视。另外，产酶菌株已从产单一碳青霉烯酶发展到产多种碳青霉烯酶，研究发现同时产多种产碳青霉烯酶会增加菌株耐药性，进而增加临床用药难度。面对CRE的快速传播，实验室应根据本地区CRE流行特点，选择高灵敏度及高特异度的检测方法对CRE早期检测，以期在一定程度上控制CRE的感染和流行，同时，对CRE耐药机制的深入研究将有助于指导临床合理用药及新型药物的研发。