刘梦宇，吴氢凯

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40周岁以前因妊娠以外的原因导致提前闭经，并伴有血清雌激素下降、促性腺激素升高的特征。欧洲人类生殖和胚胎学学会（ESHRE）将POI定义为40周岁以下女性，因除妊娠以外的原因导致闭经至少4个月，而且卵泡期血清检查至少2次（2次检查间隔时间30 d以上）出现卵泡刺激素（FSH）＞25 IU/L、雌二醇（E2）＜73.2 pmol/L[1]。对于FSH＞40 IU/L的患者过去又称为卵巢早衰（premature ovarian failure，POF），该综述对干细胞及其外泌体（exosomes）对POI及POF的最新研究进展一并介绍。POI的病因较为复杂，仍有50%～90%的特发性患者未能明确病因，已知的病因包括：遗传学因素、医源性因素、自身免疫学、先天性酶缺乏、感染与环境因素等。对于自身免疫因素引起的POI患者，免疫抑制治疗为其首选方式，但长期应用仍存在免疫功能缺陷所致的各类风险。目前临床上对无明显激素禁忌证的患者，均建议采取激素替代治疗（hormone replacement therapy，HRT），至少应用至平均绝经年龄。虽然HRT可缓解因激素缺乏导致的更年期症状，但长期应用也会增加血栓和肿瘤等风险。同时，HRT并不能恢复卵巢的内分泌和排卵功能，对有生育要求的患者无能为力。干细胞（stem cells）是一种具有自我更新能力及多向分化潜能的细胞，干细胞来源的外泌体是一种由干细胞分泌产生的微小囊泡，可携带多种生物活性物质。近年来干细胞及其外泌体应用于POI生物治疗的研究日益增多，本文就不同干细胞及其外泌体对POI的生物学作用和可能的作用机制进行综述。

1 干细胞应用于POI治疗

干细胞是一类具有多向分化潜能、无限增殖能力的原始未分化细胞，根据其发生来源可分为胚胎干细胞（embryonic stem cells）和成体干细胞。胚胎干细胞来源于囊胚内细胞团，在体外培养中仍具有向三胚层组织分化的潜能。但因其来源有限、体内致瘤性强以及涉及伦理争议等问题，在临床应用中受到限制。成体干细胞可来源于多种已分化组织中的未分化细胞，如骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞等。成体干细胞具有来源丰富、免疫原性低、易于体外分离培养等特点，在多种组织修复和细胞治疗领域已得到广泛应用。近年来，干细胞因其高度增殖、多向分化等优势被应用于POI的研究中，并取得一定疗效。

1.1 成体组织间充质干细胞用于POI/POF治疗

1.1.1 人骨髓干细胞（human bone marrow-derived stem cells，hBMDSCs） 及人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMMSCs） hBMDSCs是一组具有多向分化潜能的异质性单核细胞，包括多种造血干细胞、hBM-MSCs和内皮祖细胞。其中hBM-MSCs含量不足1%。

hBMDSCs及分离的hBM-MSCs在POF的研究中均有应用。Herraiz等[2]将hBMDSCs经尾静脉注射入化疗诱导POF小鼠及人卵巢移植小鼠（来自POF患者的卵巢皮质组织）两种动物模型体内，可观察到hBMDSCs对卵巢组织的多重再生作用，包括增加局部血管形成、增加卵泡和基质细胞数目、恢复生育力等。相比hBMDSCs，hBM-MSCs在治疗POF的研究中已取得大量成果。Bao等[3]发现POI小鼠接受hBM-MSCs治疗后，卵巢内各级卵泡数目增加、性激素水平和生育力均可得到恢复。目前更多的学者倾向于hBM-MSCs可向受损卵巢间质组织迁移，但不向卵细胞分化，而是通过旁分泌途径分泌相关细胞因子改善卵巢间质微环境，促进组织修复。例如：Khanmohammadi等[4]发现hBM-MSCs的条件培养基浓缩液可达到与hBM-MSCs相似的治疗效果，提示旁分泌途径在hBM-MSCs治疗POF中也发挥了重要作用。对于hBM-MSCs作用机制的研究还包括：抑制卵巢颗粒细胞凋亡、促进血管生成、减少细胞外基质沉积从而抗卵巢组织纤维化、抑制炎症反应以及hBM-MSCs分化为卵巢颗粒样细胞等。目前hBM-MSCs修复卵巢功能的作用已在多种动物模型上得到验证，在临床治疗中，POF患者通过hBMMSCs移植后改善内分泌水平、恢复排卵，甚至自然妊娠并分娩健康婴儿的临床案例也已有报道[5]。在迄今为止发表的3篇研究中，共有41例POF患者，其中接受自体hBM-MSCs移植后有3例成功妊娠[5-6]。

1.1.2 人脂肪间充质干细胞（human adipose derive mesenchymalstem cells，hADSCs） hADSCs 与hBM-MSCs具有相似的性质，在不同条件下可诱导分化为多种中胚层来源细胞，并具有取材方便、可自体移植降低免疫排斥反应的优势。在化疗诱导POF小鼠中，Sun等[7]将hADSCs通过尾静脉注射和双侧卵巢原位注射两种方式对POF小鼠进行治疗，发现hADSCs定位于卵巢间质而非直接分化为卵泡结构细胞，且小鼠排卵数目增加。在自然衰老小鼠模型中，Ding等[8]发现hADSCs分泌的肝细胞生长因子（HGF）与碱性成纤维生长因子（bFGF）可激活细胞沉默调节蛋白1/叉头转录因子O1（SIRT1/FOXO1）信号通路，减轻氧化应激反应，改善小鼠卵巢功能。除单独使用hADSCs外，hADSCs还可与其他生物制剂联合使用，进一步提高治疗效果。Su等[9]将可溶性胶原负载hADSCs后移植入卵巢组织中，延长hADSCs停留时间至4周，可较单一hADSCs移植取得更佳治疗效果[10]，为探索hADSCs治疗POI的机制提供重要线索。

1.1.3 人月经血来源间充质干细胞（human menstrual blood stem cells，hMenSCs） hMenSCs 是从人月经血中分离的具有高度增殖能力的一类干细胞。hMenSCs及其条件培养基在抑制卵泡闭锁、促进激素恢复和提高小鼠生育力方面，取得了与其他间充质干细胞相似的效果[11]，此外，hMenSCs与卵巢颗粒细胞还存在着密不可分的关系。Manshadi等[12]将细胞膜红色荧光探针标记的hMenSCs经尾静脉移植入POF大鼠体内，可检测到其定位在未成熟的卵泡颗粒细胞层内，并增加了抗苗勒管激素（AMH）、FSH受体（FSHR）、雌二醇（E2）、孕酮（P4）的表达量，进而对卵泡生成和排卵过程起调节作用。进一步实验表明，定位于卵巢内的hMenSCs经过卵巢组织微环境刺激，较未移植前hMenSCs可表达更多的与人卵巢组织相同的mRNA[13]。化疗损伤所致POF多数原因是由于卵巢颗粒细胞凋亡，Yan等[14]发现体外实验中化疗药物多柔比星的确可导致人卵巢颗粒细胞凋亡，但hMenSCs可通过抑制生长停滞DNA损伤可诱导蛋白 B（Gadd45b）、促进细胞周期蛋白 B1（CyclinB1）和CDC2蛋白表达，修复损伤的颗粒细胞。

1.1.4 卵巢生殖干细胞 长期以来，人们一直认为成年哺乳动物自出生后，卵巢内具有一定数量卵母细胞且不再产生新的卵母细胞。最近的证据表明，从成年小鼠和人类卵巢中均可在体外分离和培养出雌性生殖干细胞（female germline stem cells，FGSCs）。近来也报道卵巢皮质层活组织切片中存在卵巢间充质干细胞。经基因分析表明，不同于成纤维细胞和hBMMSCs的是，卵巢间充质干细胞还表达CD44、CD90和基质细胞前体表面抗原1（stromal cell antigen-1，STRO-1）[15]。Wu 等[16]从增强绿色荧光蛋白（EGFP）转基因鼠卵巢组织内分离出鼠卵原干细胞并移植入POF小鼠体内，观察到卵巢干细胞具有向卵巢皮质层归巢定位的效应，继而可分化为早期卵母细胞，并具有和正常卵泡相似的发育过程，也可对受损卵巢起到修复作用。

1.2 胎儿附属物来源的干细胞用于POI/POF治疗胎儿附属物是指在胎儿出生后，除胎儿以外的其他组织，包括胎盘、胎膜、脐带和羊水，其中胎盘羊膜层、脐血和羊水均可分离出相应间充质干细胞。这类细胞具有取材方便、来源丰富及细胞增殖能力强等优势，是一种理想的干细胞来源。

1.2.1 人胎盘间充质干细胞（human placentaderived mesenchymal stem cells，hPMSCs） 目 前 ，对于hPMSCs治疗POF的研究表明，hPMSCs主要通过免疫调节而发挥作用。透明带3多肽（pZP3）免疫损伤诱导的POF小鼠给予hPMSCs移植后，观察到卵巢组织内闭锁卵泡减少，颗粒细胞凋亡减少，且AMH及FSHR表达均增加[17]。在机制研究方面，Yin等[18]认为hPMSCs可以通过影响磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路、调节辅助性T细胞17/细胞毒 T细胞 17（Th17/Tc17）与 Th17/调节性 T细胞（Treg）之间平衡，减少卵泡闭锁及颗粒细胞凋亡。此外，hPMSCs对小鼠卵巢免疫调节的作用还包括抑制CD25+CD4+Treg细胞增殖及分泌功能、抑制γ干扰素（IFN-γ）和转化生长因子 β（TGF-β）介导的炎症反应等，以上方式均可减轻自身免疫反应对卵巢组织造成的损伤。除调节免疫反应外，移植hPMSCs后也可减轻由内质网应激肌醇依赖性激酶1α（IRE1α）信号通路引起的颗粒细胞凋亡[19]。

1.2.2 人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells，hAECs） 及 人 羊 膜 间 充 质 干 细 胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs） hAECs和hAMSCs是从人羊膜中分离出的两种类似的干细胞群，两者均具有早期外胚层细胞多能分化的特性，并且可在法律和伦理允许的范围内使用，因此hAECs和hAMSCs具有易获取和非侵入性获取等优点，是用于同种异体移植和再生医学的重要干细胞来源。Zhang等[20]研究表明hAECs及其条件培养基均可通过旁分泌途径激活TGF-β/Smad通路、促进血管生成，进而修复卵巢功能。在hAECs培养基上清液中也检测到多种与细胞凋亡、细胞周期、免疫应答相关的活性物质。Ding等[21]对自然衰老小鼠给予hAMSCs治疗，发现hAMSCs通过分泌HGF和表皮细胞生长因子（EGF），促进卵巢颗粒细胞增殖、抑制其凋亡进而增加卵巢内卵泡数目，恢复小鼠激素水平。以上研究表明hAECs和hAMSCs对小鼠卵巢功能均有一定的提升。Ding等[22]将hAMSCs与hAECs进行对比研究，结果表明hAMSCs比hAECs能更有效地改善卵巢功能，其原因为hAMSCs的生物学特性（端粒酶活性、细胞因子及胶原蛋白分泌水平）更优于hAECs。

1.2.3 人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs） hUCMSCs 是一种从新生儿脐带华通氏胶中分离出的多能干细胞，具有与hBM-MSCs相似的免疫表型。Song等[23]发现hUCMSCs可能通过分泌血管生长因子，如HGF、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板生长因子（PGF）、TGF-β等促进卵巢修复。Zheng等[24]研究发现hUCMSCs可通过调节神经生长因子/神经生长因子受体（NGF/TrkA）通路减少颗粒细胞凋亡，进而促进卵巢功能恢复。hUCMSCs对卵巢的修复作用在化疗诱导及自然衰老动物模型[25]中均已被报道。在临床治疗中，Ding等[26]发现hUCMSCs可通过磷酸化FOXO3、FOXO1，激活原始卵泡；将胶原蛋白负载的hUCMSCs移植入长期不孕的POF患者，观察到hUCMSCs可促进卵泡生成及活化、增加窦状卵泡数目，并有1例成功妊娠。

1.2.4 人羊水干细胞（human amniotic fluid stem cells，hAFSCs） hAFSCs是从羊水中分离培养的一种具有多向分化潜能的干细胞，而羊水可从产前诊断羊水穿刺时或分娩过程中收集获得，取材相对简单且不涉及伦理问题，但可能存在有创操作的风险。Liu等[27]首次将hAFSCs注射入化疗损伤POF小鼠模型体内，并观察到hAFSCs可在小鼠卵巢内存活较长时间并继续增殖。进一步研究表明，hAFSCs可抑制小鼠卵泡闭锁，促进卵泡发育、改善血清激素水平以及改善小鼠生育状况[28]。

1.3 诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）iPS指通过导入人工诱导编程的方法使体细胞去分化为多能干细胞，iPS类似胚胎干细胞，具有强大的自我更新和多向分化潜能。Liu等[29-30]在体外通过转染微小RNA-17-3p（miR-17-3p）成功将人iPS诱导分化为卵巢上皮样细胞（ovarianepitheliallike cells，OSE），继而将OSE移植入POF小鼠体内，观察到其不仅可以促进卵巢颗粒细胞增殖、生长，还可维持卵巢微环境促进卵泡发育成熟。众所周知，卵巢功能的恢复与卵巢颗粒细胞密不可分，将鼠iPS细胞与卵巢颗粒细胞共培养后发现，颗粒细胞雌激素分泌水平明显提高[31]。

2 干细胞来源的外泌体用于POI/POF治疗

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是一种可由多种细胞分泌产生的微小膜泡，具有脂质双分子膜结构，其内携带多种生物活性物质，如生长因子、活性蛋白、mRNAs、长链非编码 RNA（lncRNAs）、微小RNA（miRNAs）等，通过调节细胞间通讯可发挥促进组织损伤修复、影响肿瘤生长迁移等作用[32-33]。细胞外囊泡包含多种亚群，根据其合成及释放途径可分为：起源于细胞内体的外泌体，直径在30～150 nm之间，密度约为1.11～1.19 g/mL；衍生于细胞质膜的微囊泡（microparticles/microvesicles）。但因目前针对EVs不同亚群标志物尚未形成共识，在可证明其特定起源位置之前，国际细胞外囊泡协会（ISEV）推荐使用EVs亚类型命名，如根据大小区分的物理学特征，直径小于100 nm或200 nm的称为小囊泡（small EVs，sEVs），直径≥200 nm的为中囊泡或大囊泡（medium/large EVs）[34]。干细胞来源的外泌体可发挥与其亲代干细胞类似的生物学作用，可作为治疗POF的新型无细胞治疗（cell-free therapy）方法。

hADSCs、hPMSCs等间充质干细胞的培养基上清液对于修复卵巢功能均有一定效果，进一步证实了干细胞通过旁分泌途径发挥作用的设想。Huang等[35]发现人脂肪间充质干细胞来源外泌体（human adipose stem cell-derive exosomes，hADSC-Exo） 通过上调 Smad2、Smad3、Smad5 表达，抑制 Fas、FasL、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、caspase-8凋亡蛋白表达，从而抑制颗粒细胞凋亡，修复卵巢功能。在外泌体治疗POI的研究中，多种miRNAs发挥了重要作用。Zhang等[36]研究表明人羊膜上皮细胞来源外泌体（exosomes derived from human amniotic epithelial cells，hAECs-Exo）可通过传递 miR-1246等多种miRNAs，抑制化疗药物引起的卵巢颗粒细胞凋亡。Xiao等[37]发现羊水干细胞来源外泌体（exosomes derived from amniotic fluid stem cells，AFSCs-Exo）可减少化疗致POF小鼠卵巢内闭锁卵泡数目，同时体外实验证明AFSCs-Exo通过传递其包含的miR-10a抑制环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）诱导的卵巢颗粒细胞凋亡。此外，骨髓间充质干细胞来源外泌体也可传递miR-144-5p，调节PTEN/PI3K/AKT通路，进而保护化疗后大鼠体内卵泡闭锁[38]。因此干细胞旁分泌的作用可以部分归因于外泌体，但目前研究数据较少，各类干细胞来源外泌体对于POI的治疗效果及其机制还需进一步评估。

3 结语与展望

POI是导致不孕不育的重要原因之一，但由于其病因复杂、发病机制不明确，临床上尚未找到特定的治疗方法。随着再生医学的发展，干细胞及其外泌体治疗为修复卵巢功能、恢复生育能力提供了新的希望。在动物模型中干细胞移植的效果已被大量证实，但在临床应用中还鲜有报道，并且对于干细胞移植所需要的数量和移植方法还处在探索阶段，未形成基本共识。对于POI患者来说，干细胞移植的安全性评估永远是干细胞治疗的重要内容。部分干细胞在移植入体内后可能会失去其高度增殖和分化的特性，甚至不断累积表观遗传学的修饰作用、产生染色体突变等风险。因此在真正用于临床治疗之前，以上问题均需要继续开展相应实验进行研究。近年来由于干细胞移植存在植入细胞存活率低、伦理争议、来源有限、成瘤及免疫排斥风险的问题，干细胞旁分泌作用的研究越来越受到关注，并提出了无细胞治疗的生物治疗方式。其中干细胞来源外泌体较干细胞免疫排斥几率更低，可以避免或减轻移植后异常分化和炎症相关问题的风险。外泌体在保持干细胞生物作用的同时，又能规避其缺陷，有望成为POI的一种新型治疗方法。但目前对于外泌体治疗POI的文献较少，其作用机制及安全性仍需进一步实验探索。