董艺凝，陈卫，陈海琴*，赵建新，陈永泉，张灏

1(滁州学院 生物与食品工程学院，安徽 滁州，239000)2(江南大学 食品学院,食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122)

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)全称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactosidegalacto hydrolase, EC.3.2.1.23)，具有水解和转糖苷两种催化功能[1-2]。工业上以乳糖为底物，利用β-半乳糖苷酶的转糖苷催化活性合成低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides, GOS)，这种功能性低聚糖能够调控肠道益生菌生长[3]。根据氨基酸序列相似性分类，β-半乳糖苷酶分属于糖苷水解酶GH1，GH2，GH35，GH42，GH50和GH59家族[4-5]。其中，嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)来源β-半乳糖苷酶BgaB属于GH42家族，是一种具有工业应用潜力的耐热酶[6]。耐热β-半乳糖苷酶可在相对高温条件下保持稳定性及催化活性。高温条件能够提高浓度底物，降低水分作为受体的竞争性，进而提高转糖苷与水解催化比率(transglycosylation-to-hydrolysis, T/H)。因此，耐热β-半乳糖苷酶在高温催化合成GOS工艺方面具有显著技术优势，并有望突破现有产量瓶颈[7-9]。但GH42家族原核微生物来源的β-半乳糖苷酶通常对乳糖催化活性较弱，并导致转糖苷产物GOS合成量较低[10-12]。这也是GH42家族原核微生物来源耐热β-半乳糖苷酶的共性问题。

目前，GH42家族已有9个晶体结构报道[13-15]。本研究前期以β-半乳糖苷酶晶体结构为模板，通过同源建模及定点突变的方法，对部分影响底物结合的氨基酸位点进行了功能探讨[16-18]。现有研究显示起到亲核催化作用的氨基酸位置及类型，对酶的催化活性至关重要。如2013年SABURI等研究发现，亲核催化氨基酸残基(—COO-)被半胱氨酸(Cys)巯基(—SH)替换并氧化后，提高了葡聚糖酶(dexran glucosidase)转糖苷活性[19]；2010年COCKBURN等采用类似方法对Cellulomonasfimi来源纤维素酶CenA两个推测催化位点Asp392和Asp216进行半胱氨酸替换和化学修饰，优化了CenA的最适作用pH[20]。

基于上述研究发现，本文以GH42家族Geobacillusstearothermophilus来源耐热β-半乳糖苷酶BgaB为研究对象，通过对催化氨基酸位点的改造与突变体催化特性分析，初步探讨了催化氨基酸位点突变对β-半乳糖苷酶转糖苷活性的影响。本研究为GH42家族β-半乳糖苷酶的功能改造及应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株和质粒

Escherichiacoli(E.coli) JM109 (recA1，supE44，endA1，hsdR17，gyrA96，relA1，thi，Δ([lac-proAB] F’ [traD36，proAB+，lacIq，lacZ(M15])，DH5α (supE44 ΔlacU169hsdR17 (Φ80lacZΔM15)RecA1endA1gyrA96thi-1relA1)，质粒载体pKK223-3,均由江南大学食品生物技术中心菌种库提供。

1.1.2 生化试剂

氨苄青霉素(Amp)，上海生工；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶，Takara公司；KOD plus高保真DNA聚合酶，Toyobo公司；DpnI，Fermentas公司；DNA琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；PCR产物纯化试剂盒，北京天根生化科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，北京庄盟生物基因科技有限公司；镍亲和柱(Ni-Chelaing Column)，Qingen公司。

1.1.3 仪器与设备

GS00001PCR仪，G-STROM公司；5415R/5804R冷冻离心机，Eppendorff公司；Power pac核酸电泳仪，Basic 041BR蛋白质电泳仪，Geldoc 2000凝胶成像系统，Bio-Rad Laboratories公司；UV-2100可见分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司；VCX500超声波破碎仪，Sonics&Materials公司；Discovery Sdudio分子动力学模拟软，BIOVIA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 同源建模

BgaB同源序列应用PSI-BLAST算法[21]，在NCBI(National Center for Biotechnology Information)无冗余数据库(non-redundant database)中检索获得。多重序列比对、BgaB同源分子结构模拟及底物对接采用Discovery Studio软件完成。基于序列比对分析，选择ThermusthermophilusA4来源的β-半乳糖苷酶(A4-β-Gal)晶体结构(PDB∶1KWK)，作为模板。

1.2.2 E303C定点突变体的构建[22]

以本实验室已构建质粒pKK223-3-bgaB为模板，采用快速全质粒扩增突变法(QuickChange®ite-directed mutagenesis protocol)针对选择位点构建Cys替换单点突变体，引物设计如表1所示。

1.2.3 野生型及突变体酶的表达与纯化

挑选野生型与突变体重组菌单克隆接种于5 mL LBA(含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB)培养基中，37 ℃下振荡培养过夜。按1%接种量将饱和种子液接种于200 mL LBA培养基中，37 ℃振荡培养至OD600达到0.6～1.0时，添加IPTG(终浓度达1 mmol/L)于20 ℃过夜诱导表达。收集菌体用100 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)重悬，超声波破壁。粗酶液过镍亲和柱纯化得纯化酶蛋白样品。

表1 定点突变引物核酸序列

1.2.4 突变体的氧化[23]

突变体酶采用KI进行氧化，以野生型酶作为对照，在相同的条件下进行氧化处理。为确定最优KI处理浓度，氧化反应体系设定为100 μL，含10 μmol/L Br，50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 6.5)，0～300 mmol/L KI，3 μmol/L 野生型及突变体酶。氧化体系经25 ℃处理30 h后测定酶活。

1.2.5 β-半乳糖苷酶比酶活测定

按Gist-Bracades法测定耐热β-半乳糖苷酶酶活，并以BgaB最适作用条件设定反应温度及pH[24]。取100 μL酶液和900 μL磷酸盐缓冲液(pH=6.5)加入10 mL试管中混匀，加5.0 mLoNPG 55 ℃精确反应10 min后，置于冰水浴中并加入2.0 mL Na2CO3溶液终止反应。室温下用分光光度计(420 nm)以空白值为参比测定样品吸光度。酶蛋白质含量采用BCA法测定，按公式(1)计算酶活：

(1)

式中：E420,420 nm处的吸光度值；Ew，0.1 mL所用酶液含酶的重量(g)；8,反应总体积；10,反应时间(min)；4.45,在实验条件下1 μmoloNP/mL的吸光度值。

1.2.6 转糖苷产物测定

在标准氧化反应条件下(pH 6.5，55 ℃，50 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液)，加入乳糖作为反应底物，反应30 h后，95 ℃加热5 min终止反应，取反应混合物进行薄层色谱分析。

取反应液20 μL梯度稀释后，进行高效液相色谱分析。其中乳糖、半乳糖和葡萄糖根据标准品定量，低聚半乳糖含量根据面积归一化法计算。色谱柱为TSKgel Amide-80氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相，乙腈与水按体积比70∶30混合；色谱条件为流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量15 μL；蒸发光散射检测器，漂移管温度45 ℃；N2压力3.0×105Pa。

2 结果与分析

2.1 催化氨基酸位点预测

以A4-β-gal(PDB：1KWK)为模板，采用同源建模方法构建了耐热β-半乳糖苷酶BgaB分子结构。将所得β-半乳糖苷酶BgaB同源模拟结构在Discovery Sdudio软件中进行半乳糖底物分子转接。结果如图1所示，参与底物结合的关键氨基酸位点包括Arg109、Glu148、Phe341、Trp311、Asn147、Asn310、Try272、Glu303和His354。其中，Glu148和Glu303参与底物成键数量比其他预测位点多，表明其对催化活性具有重要影响。序列比对结果显示Glu303对应于A4-β-gal亲核催化氨基酸Glu312。由此，推测Glu303为BgaB亲核催化氨基酸位点。

图1 β-半乳糖苷酶BgaB与半乳糖分子结合位点示意图

2.2 E303位点突变体的表达纯化与功能分析

本研究分别对E303位点构建了半胱氨酸(Cys)替换突变体E303C，以及丙氨酸(Ala)替换突变体E303A。Ala突变可以反映出某一氨基酸位点缺失对催化作用的影响[25]。将野生型及单点突变体酶重组表达及纯化后，均得到70 kDa单一蛋白条带，与野生型BgaB蛋白分子质量大小一致，表明突变体酶得到正确表达(图2)。

M-markers； WT-野生型；1-E303A;2-E303C

野生型及突变体酶水解活性，试验结果如表2所示。突变体酶E303A未检测到水解活性；突变体酶E303C相对野生型水解活性大幅度下降，仅为野生型酶活性的0.6%。突变体酶E303A和E303C相对野生型酶活变化情况表明，E303位点替换为Ala和Cys后出现了失活和酶活大幅度损失两种明显改变。亲核催化位点是β-半乳糖苷酶形成底物氢键结合网络及保持型糖苷水解催化机制(retaining glycoside hydrolases)的关键[26-28]。突变体酶E303A失活可能就是由于E303位点羧基(-COOH)侧链突变为丙氨酸的氢基侧链(-H)后，原有极性侧链功能缺失所致；而突变体酶E303C残留有少量酶活，可能是由于巯基侧链(-SH)与羧基侧链(-COOH)同为极性侧链，也能通过氢键结合底物从而维持部分水解催化机能。E303位点被两种不同极性氨基酸替换，均产生剧烈的酶活改变，这一实验现象符合催化氨基酸位点功能特征。由此，推断E303为BgaB的亲核催化氨基酸位点。

表2 野生型及突变体酶以oNPG为底物的比酶活

注：“-”表示未测出。

2.3 E303C突变体巯基侧链氧化

以野生型酶为对照，氧化剂(KI)浓度对野生型及突变体酶水解活性影响如图3-a所示。Ox-E303C突变体酶活随KI浓度的增大而增加；当KI浓度达到200 mmol/L后，酶活保持稳定，表明巯基侧链氧化完成。而野生型酶在0～300 mmol/L KI浓度处理范围内，酶活没有明显变化；当KI浓度增大到200 mmol/L后，酶活降低至原来的65%。试验结果表明200 mmol/L KI为最适氧化浓度。在最适KI浓度条件下，处理时间对突变体酶及野生型酶活影响如图3-b所示。Ox-E303C酶活在192 h达到最大，并保持稳定。试验结果表明经200 mmol/L KI氧化处理192 h可以获得稳定Ox-E303C突变体酶。

a-KI浓度对酶活的影响；b-处理时间对酶活的影响

2.4 Ox-E303C突变体转糖苷催化活性鉴定

β-半乳糖苷酶可将乳糖分解为半乳糖、葡萄糖，并将单糖转接到半乳糖分子上，形成乳糖以及聚合度大于2的系列低聚半乳糖[29]。野生型及突变体酶Ox-E303C、E303C反应产物TLC结果如图4所示。

与E303C突变体酶和野生型酶相比，突变体酶Ox-E303C除了含有乳糖、葡萄糖和半乳糖外，产物组分中还多了低聚半乳糖显色斑；同时，突变体酶E303C较野生型酶多了乳糖色斑，可能是由于其水解活性弱，相同反应条件下乳糖水解不完全所致。TLC分析结果初步表明，Ox-E303C突变体具有转糖苷催化能力；而野生型酶和突变体酶E303C没有转糖苷产物检出，表明转糖苷催化活性缺失或过弱。

野生型酶、E303C和Ox-E303C突变体酶反应终产物的HPLC结果如图5所示。野生型酶产物组分为半乳糖和葡萄糖(图5-a)；E303C突变体水解活性相对野生型酶低，相同条件下底物乳糖水解不充分，产物组分中除了半乳糖和葡萄糖，还含有残留底物乳糖峰(10.087 min)(图5-b)。与野生型及E303C突变体酶相比，Ox-E303C反应产物在20.783 min出现了新组分峰，聚合度量大于单糖和乳糖，为GOS产物。在氨基柱色谱条件下GOS显示为单峰(图5-c)，其相对峰面积占产物组分总量的11.5%。这一结果表明Ox-E303C突变体酶相对野生型酶和E303C突变体酶生成了转糖苷催化活性。结合TLC分析可知，其转糖苷催化产物GOS由3～4个组分构成。相同试验条件下，Ox-E303C可将野生型酶GOS合成量由0%提高到11.5%。

3 结论

本研究以GH42家族Geobacillusstearothermophilus来源耐热β-半乳糖苷酶BgaB为研究对象，通过对氨基酸位点Glu303进行Ala替换及突变体活性分析，预测了该位点的亲和催化氨基酸功能。采用定点突变与化学修饰相结合的方法对Glu303位点的改造与突变体性质分析结果表明，以—SOO-替换亲和催化氨基酸侧链，能够提高耐热β-半乳糖苷酶BgaB的转糖苷催化能力。转糖苷活性低是GH42家族β-半乳糖苷酶的共性问题，本研究针对BgaB催化氨基酸位点的改造与功能研究结果，对GH42家族β-半乳糖苷酶转糖苷催化活性的改造及调控具有广泛的参考价值。

M-markers；WT-野生型；1-E303C；2-OX-E303C