胡 悦， 付 芸， 李欣阳， 李永亮

长春理工大学光电工程学院， 吉林 长春 130022

引 言

肝癌始发于肝部细胞的癌变， 是死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。 肝癌早期症状不明显， 常会发生贻误病机的情况。 肝纤维化最早形成是因为肝脏发生炎症而受损， 当肝脏炎症逐渐加剧， 肝纤维化程度增加形成的肝脏瘢痕组织积聚时， 将会大大提高肝癌的发生概率。 肝纤维化因其引发原因复杂， 暂无明确检测方式。 荧光光谱技术已经应用在多种疾病及肿瘤检测过程中。 荧光光谱技术由于其准确性高， 稳定性强， 且方便易测等优势[2]， 已经广泛应用于医学检测领域。 细胞病变过程会产生不同代谢产物， 肝纤维及肝癌细胞内光敏物质受到激发后， 产生不同谱线形状或强度的荧光光谱， 由此分析肝纤维及肝癌细胞内部代谢物质的变化， 这是细胞自体荧光光谱用于生命医学领域的理论基础[3]。 本研究对比肝纤维及两种肝癌细胞的荧光光谱与正常肝细胞的光谱差异， 并结合高斯多峰拟合、 流式细胞仪分析以及非线性拟合分析， 对比四种细胞研究了荧光饱和趋势与细胞直径的关系。 目的在于， 为实现肝癌及肝纤维早期筛查工作提供光谱学依据。

1 实验部分

1.1 仪器

荧光光谱仪选用FL6500测量细胞悬浮液， 狭缝的光谱带宽为10.0 nm， 激发波长488 nm， 发射波长530～750 nm， 激发波长间隔1 nm， 平均时间0.1 s， 扫描速度600 nm·min-1。 比色皿规格选择0.9 mL， 每次检测后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗去除比色皿内残余样液。 流式细胞仪选择BD Accuri C6型号， 激发光源488 nm， 通道选择FSC-H， SSC-H。

1.2 样品制备

选用四种细胞分别为： 肝细胞 HL-7702[L-02]； 肝纤维细胞 LX-2； 肝癌细胞 HepG-2； 肝癌细胞 SMMC-7721(均采购于上海富衡细胞库)。 培养体系选择加入10%新生牛血清、 1%双抗的RPMI-1640培养基， 置于37 ℃， 5%CO2饱和湿度的无菌培养箱。 防止细胞生长代数影响， 选择培养至一定数量的相同代数细胞。 对四种细胞分别计数， 配置细胞浓度为1.25×105， 2.5×105， 5.0×105， 1×106和2×106cells·mL-1细胞悬浮液， 每种浓度3组。 三组不添加细胞的PBS溶液， 用于去拉曼散射。 每种细胞分别配置200 μm细胞数为1×105cells的细胞悬浮液， 重复3组， 用于流式细胞实验。

1.3 荧光数据处理

在对细胞悬浮液进行检测时， 会受到很多因素的影响， 包括温度、 细胞活性、 pH值等。 除此之外， 细胞悬浮液中的PBS在激发光作用下会发射出拉曼光， 产生背景噪声[4]。 为了获得细胞的荧光光谱， 需要去除PBS的发射谱影响， 如图1所示， 细胞浓度是1.25×105cells·mL-1时拉曼散射对荧光光谱的影响。

图1 拉曼散射对荧光光谱的影响

对获得的荧光光谱结果， 均需要去除拉曼光的影响， 如图2所示， 图2(a—d)分别为去除拉曼光谱影响后， 五种浓度下肝细胞、 两种肝癌细胞、 肝纤维细胞的自体荧光光谱。

1.4 高斯多峰拟合

高斯多峰拟合法能够精确给出荧光峰的位置， 每个单峰的展宽和强度值， 适用于对荧光光谱图进行精确分析。 还可以结合高斯多峰拟合的相应数值来判断代谢物质含量差异， 并根据获得的最大峰值， 分析细胞荧光饱和强度趋势变化。 图3(a—d)分别是对5.0×105cells·mL-1浓度下四种细胞的高斯多峰拟合结果。 表1， 表2， 表3， 表4分别为四种细胞的高斯多峰拟合参数。

图2 5种细胞5个不同浓度的自体荧光光谱

(a): hepatic cell HL-7702[L-02] (b): hepatoma carcinoma cell HepG-2; (c): Hepatic fibrosis cell LX-2; (d): hepatoma carcinoma cell SMMC-7721

图3 (a)： Hl的高斯多峰拟合； (b)： Hep的高斯多峰拟合； (c)： Lx的高斯多峰拟合； (d): SMMC的高斯多峰拟合

Fig.3 (a): Gauss multi-peak fitting of HL; (b): Gauss multi-peak fitting of Hep; (c): Gauss multi-peak fitting of LX; (d): Gauss multi-peak fitting of SMMC

1.5 流式数据处理

利用流式细胞仪分析肝纤维、 肝癌细胞及正常肝细胞， 能够获得前向角散射光和侧向角散射光双参数散点图， 如图4所示， 为肝癌细胞Hep的流式细胞结果图。 前向散射角与细胞直径平方密切相关， 选择FSC作为阈值可以排除样品碎片以及鞘液中小液滴的干扰[5]。 利用图像辅助流式细胞仪， 可以一次观察大数量细胞情况， 图中每个点均代表一个细胞， 通过分析横轴SSC-H、 纵轴FSC-H细胞群落分布及聚集状态， 可以分析四种细胞直径特点[6]。

表1 HL的高斯多峰拟合参数

表2 Hep的高斯多峰拟合参数

表3 LX的高斯多峰拟合参数

表4 SMMC的高斯多峰拟合参数

图4 Hep的流式细胞散点图

2 结果与讨论

2.1 自体荧光光谱分析

对细胞悬浮液进行荧光光谱检测时， 需要考虑到PBS溶液拉曼散射的干扰， 如图1所示， 需对结果进行去拉曼散射处理。

四种细胞悬浮液在488 nm波长的光激发下， 获得特异性荧光发射谱。 3组平行实验的结果近乎相同， 造成差异的原因可能是细胞悬浮液配置不均匀造成， 实验先后顺序不同， 此外， 细胞状态有略微差异也会干扰实验结果， 但结果具有可靠性。 如图2所示， 为五种浓度细胞悬浮液的荧光光谱。 可以发现， 如图2(a)所示， 肝细胞在550～750 nm之间存在两个特异性荧光峰， 第一个峰值明显高于第二个峰； 如图2(b)和(d)所示， 肝癌细胞在550～750 nm之间存在三个特异性荧光峰， 第一个峰值最高， 第三个峰高于第二个峰； 如图2(c)所示， 肝纤维细胞在550～750 nm之间存在三个特异性荧光峰， 第一个峰值最高， 第三个峰其次， 走势和两种肝癌细胞相似。 对比结果， 同种浓度下肝癌细胞最大荧光强度高于肝纤维细胞高于肝细胞。

结合高斯多峰拟合结果， 如图3所示， 高斯多峰拟合效果贴近实验所得谱线， 能够对结果进行精确分析。 结合高斯多峰拟合参数， 如表1所示， 肝细胞第一个峰值位于592 nm处， 第二个峰位于682 nm处； 如表2， 表3， 表4所示， 肝癌， 肝纤维细胞除具有与肝细胞相同位置的两个峰外， 在726 nm处存在第三个特异性荧光峰。 肝癌细胞和肝纤维细胞三个峰的展宽基本相同， 正常肝细胞最大激发峰展宽略小于另外三种细胞， 但是682 nm处的小峰展宽略大于病变细胞。 相同浓度下， 肝细胞两个峰的荧光强度均低于另外三种细胞； 肝癌细胞三个峰的荧光强度略高于肝纤维细胞； 两种肝癌细胞谱形相似， Hep的最大荧光强度略大于SMMC， 且726 nm处的荧光峰明显高于SMMC。

结果说明， 肝癌和肝纤维细胞在代谢过程中， 产生了同种激发峰的代谢产物， 而正常肝细胞并不具备。 发生病变的细胞在代谢过程中， 不仅代谢物质种类发生变异， 物质含量变化也十分明显。

细胞由于内源性荧光物质的差异， 荧光光谱形状也会改变。 蛋白质是细胞主要组成物质， 占细胞干重的一半以上， 能够在300～350 nm范围显示出强荧光[7]。 细胞中的脂褐素的最大激发波长为340～395 nm， 最大发射波长为540～640 nm。 内源性卟啉是一种大共轭环状结构的金属有机化合物， 具有很强的荧光， 原卟啉粉末在红光区有三个荧光峰， 分别位于628， 727和762 nm附近[8]。 荧光光谱检测结果显示， 肝病变细胞与健康细胞的光谱差异可能与卟啉或卟啉类结合物的产生有关。

2.2 荧光饱和强度分析

在以往研究中发现细胞最大荧光强度的饱和现象与细胞大小相关。 图4是利用流式细胞仪分析， 获得的荧光信号分布图， 图上每一个点均代表一个细胞。 结果显示四种细胞直径比较集中， 肝细胞直径明显小于病变细胞， 肝癌细胞直径最大， Hep细胞略大于SMMC细胞。

为了研究肝细胞、 肝癌细胞及肝纤维细胞的饱和程度趋势， 可以通过高斯多峰拟合结果， 获得每组细胞最大荧光强度， 并通过非线性拟合， 获得最大荧光强度随浓度变化曲线。 通过Origin 8.0 软件进行数据分析处理， 系统比较了多个非线性拟合方程， 调整参数， 对比结果， 最终选择了具有最佳非线性拟合效果的Exponential-exp3p1， 结果显示Adj.R-Square值高达0.996， 拟合效果与预期相符。

对比细胞最大荧光强度随浓度变化曲线， 如图5所示， 横轴表示不同浓度梯度， 纵轴表示不同浓度下的最大荧光强度， 对拟合曲线图进行分析， 结果发现四种细胞的最大荧光强度随着细胞浓度增大而增强， 但是逐渐会呈现荧光饱和状态， 单个细胞自激发荧光效率降低。 相比另外三种细胞， 肝细胞荧光饱和强度随着浓度增大荧光强度增速降低， 明显呈现出饱和趋势， 但是饱和度相对较小。 两种肝癌细胞和肝纤维细胞趋势相近， 肝癌细胞荧光饱和程度高于肝纤维细胞， 饱和趋势也更为明显。 结合流式细胞结果， 细胞直径越大， 荧光强度越大， 越容易呈现出荧光强度饱和的趋势。

图5 荧光饱和趋势分析

3 结 论

对细胞悬浮液检测时， 需除去拉曼散射对光谱的影响。 肝癌， 肝纤维细胞除具备与肝细胞相同位置的两个峰外， 在726 nm处存在第三个特异性荧光峰。 同种浓度下两种肝癌细胞荧光强度均高于肝纤维细胞高于肝细胞。 肝癌细胞直径大于肝纤维细胞， 肝细胞直径最小。 随着浓度增加荧光强度增速降低， 逐渐呈现出明显的饱和趋势， 单个细胞自激发效率降低等现象。 并且细胞直径越大， 同种浓度下获得的最大荧光强度越大， 呈现出荧光饱和趋势更为明显。 本工作不仅探索了肝、 肝癌、 肝纤维细胞的荧光光谱特性， 还对比了细胞的直径， 分析了荧光饱和强度变化趋势， 为研究肝部病变的早期诊断和筛查提供了光谱学依据。

致谢： 感谢长春理工大学付芸老师的指导； 感谢吉林大学张平老师提供细胞培养环境， 以及细胞培养过程的帮助和指导； 感谢长春应化所化学生物实验室高楠老师提供荧光光谱实验指导。