王建强，李 俊，马晓敏，崔璐莹，孟 霞，李建基，王 亨*

(1.扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

奶牛乳腺炎是由各类病因引起的乳腺炎症，其特征在于乳汁的物理、化学和细菌学变化，以及乳腺组织的病理变化，并严重影响着乳汁的产量和质量[1]。奶牛乳腺内感染通常由病原微生物引起，目前已知的能引起奶牛乳腺炎的病原微生物有150种之多[2]。比较常见的有金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌、克雷伯菌、链球菌等，其中以金黄色葡萄球菌较为常见，且可造成严重经济损失，不易被清除[3]。

核因子-E2相关因子2(Nrf2)信号转导通路是氧化还原反应的主要调控途径。Nrf2信号通路调控某些主要的抗氧化酶和Ⅱ期解毒酶基因的编码，例如谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCLM)、硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)、血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO-1)等[4]，因此，Nrf2信号通路在细胞抵御氧化应激的过程中起着重要的作用。有研究表明,热应激情况下奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内Nrf2及下游基因NQO-1表达升高以抵抗热应激对细胞的损伤。另有研究表明，脂多糖(LPS)与脂磷壁酸(LTA)刺激均可引起Nrf2下游基因HO-1和GCLM的上调[5]，但Nrf2信号通路是否参与了S.aureus诱导的BMECs损伤仍不明确。核因子κB(NF-κB)信号转导通路在免疫调节中起重要作用，是免疫系统正常发育、特异性免疫和非特异性免疫中所必须的，也是介导炎症的主要信号通路[6-7]。有研究显示，S.aureus感染24 h上调了小鼠乳腺内TNF-α和IL-6的表达[8]，同时，S.aureus感染BMECs 1 h后，NF-κB通路被显著激活[9]。但在S.aureus感染BMECs过程中，炎性因子及NF-κB信号通路的表达是否存在差异目前仍有待研究。本试验旨在通过体外建立的S.aureus感染BMECs模型，观察S.aureus侵袭过程中，Nrf2和NF-κB信号通路主要相关基因和蛋白表达的变化，以及对炎性因子表达的影响，为探讨奶牛乳腺炎的发病机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与设备原代BMECs由扬州大学兽医学院外科课题组进行原代培养、纯化、鉴定与保存；S.aureus(ATCC 29213)，购自美国典型菌种保存中心；无内毒素胎牛血清(Gibco，美国)；DMEM/F-12培养液、L-谷氨酰胺、Ⅱ型胶原酶(Sigma，美国)；胰蛋白酶(Amresco，美国)；兔源Nrf2抗体(Abcam，USA)；兔源β-actin、p65、P-p65、IκBα、P-IκBα抗体、山羊抗兔二抗(CST，美国)；Trizol、逆转录试剂盒、SYBR荧光染料预混液、ECL发光液(诺唯赞，中国)；BCA蛋白检测试剂盒、细胞蛋白抽提试剂盒(碧云天，中国)；PVDF膜(Millipore，德国)；蛋白电泳系统、PCR扩增仪、实时荧光定量PCR系统(Bio-Rad，美国)。

1.2 原代BMECs的分离与培养原代BMECs为本实验室通过酶消化法分离鉴定所得[10]。无菌采集健康的荷斯坦奶牛的乳腺组织，裁切成3 cm3左右立方小块，用含有300 IU/mL青链霉素的PBS反复冲洗后，置于含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，低温带回实验室进一步处理。用PBS反复清洗后，剪切成糊状，重悬洗涤，直至上清液清亮。用0.25%的Ⅱ型胶原酶按2∶1重悬组织，置于37℃培养箱内消化2～3 h。依次用20和80目的筛网过滤消化液，1 600 r/min离心6 min，收集细胞团块。使用PBS重悬并清洗细胞团块3次后，使用DMEM/F12完全培养液重悬细胞团块并置于37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。待细胞铺满80%培养瓶底面后，利用差时消化法纯化BMECs。

1.3S.aureus的培养将S.aureus(ATCC 29213)接种至血液琼脂培养皿上，37℃培养10 h,挑取单个菌落接种至20 mL LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中以120 r/ min培养至平台期。按1∶100转接至20 mL LB液体培养基中，37℃恒温摇床中以120 r/min培养至对数生长期，根据生长曲线计数备用。

1.4 qRT-PCR检测炎性因子和Nrf2信号通路关键基因表达将细胞按5×105个/孔接种至六孔培养板，待细胞汇合80%后更换无血清培养液；S.aureus按MOI = 1∶1侵染细胞。于感染后0，0.5，1，2，3，4，6，8 h提取RNA检测炎性因子；同时于感染后0，2，4，6，8 h提取RNA检测Nrf2信号通路关键基因表达水平。方法如下：使用Trizol法提取细胞总RNA，将RNA逆转录为cDNA，qRT-PCR检测Nrf2信号通路关键基因Nrf2，Keap1和NQO-1，炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-8的表达量。引物如表1所示，每个样本重复3次，并以β-actin为参照，按照2-△△Ct法计算出每个基因的相对表达量。

表1 qRT-PCR扩增引物序列

1.5 Western blot检测Nrf2蛋白和NF-κB信号通路关键蛋白表达水平将BMECs按106个/孔接种至60 mm细胞培养皿，待细胞汇合80%以上后更换无血清培养液；S.aureus按MOI = 1∶1侵染细胞。于感染后0，1，2，4，6，8 h提取蛋白检测Nrf2蛋白表达量；于感染后0，0.5，1，2，3，4，5，6 h提取蛋白检测NF-κB信号通路关键蛋白p65，P-p65，IκBα和P-IκBα表达量。方法如下：BCA法调整蛋白浓度，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。转印至PVDF膜后，在5%脱脂乳内室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜。TBST漂洗PVDF膜后，在二抗内室温孵育2 h，显影后，通过灰度值对蛋白表达进行定量分析。

1.6 统计学分析使用SPSS17.0软件对结果进行统计学分析，结果以平均值±标准差表示。*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

2 结果

2.1S.aureus侵染对Nrf2信号通路关键基因表达的影响S.aureus侵染BMECs后，Nrf2基因在侵染的2，4 h表达呈极显著上升(P<0.01)，且在6，8 h 时呈极显著下降(P<0.01)(图1A)；Keap1基因表达在侵染的2，4 h呈显著或极显著下降(P<0.05 或P<0.01)，且在侵染的8 h呈显著上升(P<0.05)(图1B)；NQO-1基因在侵染后2，4 h表达呈显著或极显著上升(P<0.05或P<0.01)(图1C)。故，S.aureus侵染细胞2，4 h时，细胞内Nrf2信号通路被激活，细胞内抗氧化水平提升；而在侵染的6，8 h时，细胞内Nrf2信号通路被抑制，细胞内抗氧化水平下降。

图1 S.aureus侵染BMECs对Nrf2通路关键基因表达的影响 A.Nrf2相对表达量；B.Keap1相对表达量；C.NQO-1相对表达量。注：与0 h相比，*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01。下同

2.2S.aureus侵染对TNF-α、IL-1β和IL-8基因表达的影响S.aureus侵染BMECs 1，2，3，4，6，8 h后，TNF-α、IL-1β和IL-8基因的表达均呈现显著或极显著上调(P<0.05或P<0.01)(图2)；故S.aureus侵染细胞后，可引发细胞内的炎性因子的合成和释放。

图2 S.aureus侵染BMECs对炎性因子基因mRNA表达的影响 A.TNF-α相对表达量；B.IL-1β相对表达量；C.IL-8相对表达量

2.3S.aureus侵染对Nrf2蛋白表达水平的影响S.aureus侵染BMECs 2 h后，Nrf2蛋白表达量显著上升(P<0.05)，而在侵染后的6，8 h，Nrf2蛋白表达量呈显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01)(图3)；故Nrf2信号通路在感染后2 h时被激活，而在感染后6，8 h时被抑制。

2.4S.aureus侵染对NF-κB信号通路关键蛋白表达水平的影响S.aureus侵染BMECs 0.5，1，2，3，4，5，6 h后，p65磷酸化水平呈显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)(图4)；IκBα磷酸化水平在感染后1，2，3，4 h呈显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)；故S.aureus侵染BMECs后，可激活NF-κB信号通路。

图3 S.aureus侵染BMECs对Nrf2蛋白表达的影响 A.Western blot检测Nrf2蛋白表达结果；B.Nrf2相对表达量

图4 S.aureus侵染BMECs对NF-κB信号通路关键蛋白表达的影响 A.Western blot检测NF-κB信号通路关键蛋白表达结果；B.p65磷酸化水平；C.IκBα磷酸化水平

3 讨论

Nrf2信号通路是细胞氧化还原的主要调控通路，在生理条件下，Keap1通过泛素化降解Nrf2，从而抑制Nrf2的转录活性[4]。而在自由基和病原的刺激下，Nrf2在DJ-1蛋白的作用下被释放并入核，Nrf2与抗氧化元件(ARE)结合后激活下游靶基因的表达[11-12]。SUN等[13]还发现在细胞氧化还原稳态恢复后，Keap1重新入核并从ARE中释放Nrf2，将Nrf2运输回胞浆中。对Nrf2基因缺失小鼠模型的研究表明，Nrf2的缺失可能会加重S.aureus引起的败血症和急性肺损伤，这说明了Nrf2信号通路在S.aureus感染过程中的重要性[14-15]。本试验结果表明，在S.aureus感染后2 h，细胞Nrf2蛋白表达显著升高，Nrf2、NQO-1基因显著上调，Keap1基因显著下调，表明S.aureus刺激激活了Nrf2信号通路，释放下游解毒酶；而在感染后6，8 h时，Nrf2表达受到抑制，说明此时S.aureus抑制了Nrf2信号通路的表达。JI等[16]发现使用LPS作用于细胞24 h后Nrf2蛋白表达量显著降低；另有研究指出，LPS似乎对Nrf2的表达无影响[17]；然而，低剂量的LPS诱导了Nrf2信号通路激活[18]，因此，Nrf2信号通路的激活可能与LPS的剂量和作用时间有关。结合本试验结果，我们推测在S.aureus感染初期，细胞通过激活Nrf2途径上调解毒酶基因(如NQO-1)的表达,而在感染后期Nrf2信号途径可能受到抑制，表明此时抗氧化系统受到损伤。这也与曾慰等[19]观察到的结果相似。

NF-κB信号通路对免疫的主要调节作用分为经典通路与非经典通路。通常情况下，p65与p50构成的NF-κB异二聚体被IκB蛋白结合，从而使NF-κB结合DNA的特性被抑制。当宿主受到病原侵袭时，病原被模式识别受体(PAMP)识别，NF-κB通路被激活，IκB蛋白在IκB激酶的作用下发生磷酸化并与p65/p50二聚体解离，该二聚体核转位并作用于相应的靶基因[6-7]。本试验研究发现，在S.aureus侵染BMECs后，p65与IκBα蛋白的磷酸化水平明显上升，表明NF-κB通路被激活，p65与IκB蛋白分离并入核表达。这与吴建美等[20]发现的结果相符。

TNF-α是一种具有多生物功能的小分子蛋白，当炎症发生时，细胞产生的促炎性因子TNF-α与膜受体结合，促进了IκB蛋白磷酸化，进一步介导p65蛋白的入核[21]。IL-1β是炎症发生早期的重要促炎因子，可由多种细胞分泌[22]，IL-1β能够提高细胞组织对TNF-α的敏感程度，同时刺激其他炎性因子产生，进一步放大炎性作用[23]。IL-8是一类趋化因子，可特异性趋化炎症细胞，是各种免疫细胞游走至炎症发生部位的关键因子[24]。关立增等[25]发现，S.aureus感染上调了BMECs内IL-6和IL-8的表达。在本试验中，在S.aureus感染后的1～8 h，BMECs内的TNF-α、IL-1β与IL-8的表达水平均显著升高，从而进一步说明细胞内炎性的发生。WANG等[26]研究表明，S.aureus诱导BMECs炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-8表达，同时NF-κB信号通路被激活，这与本试验观察的结果相一致。

综上所述，S.aureus感染BMECs后，激活了Nrf2和NF-κB信号通路，促进炎性因子的表达和释放，说明Nrf2和NF-κB信号通路可能参与了S.aureus对BMECs的氧化和损伤过程，为探讨奶牛乳腺炎发病机制和防控提供了理论依据。