巩宇红，金鑫鑫，袁勃雨，王 玮

(吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

肠道黏膜层是机体最大的黏膜层，常与大量食物来源的微生物或抗原等异物接触[1]。肠道也是机体最大的免疫器官，故而肠道黏膜免疫在机体的先天性和获得性免疫中发挥着关键作用。分泌型免疫球蛋白A (sIgA) 是肠道获得性免疫的重要标志物。sIgA是人类和其他哺乳动物黏膜表面最重要的免疫球蛋白(Ig)亚型[2-3]。肠道固有层浆细胞产生的IgA和J链形成的二聚体，经黏膜表面上皮细胞多聚免疫球蛋白受体(pIgR)转运后形成sIgA[4]。sIgA通过不同的分子机制维持肠道共生菌的生存并阻抑有害病原菌的侵入[5-6]。pIgR通过转胞吞作用将分泌型免疫球蛋白的多聚体转运到肠道上皮细胞外的黏膜中以参与免疫反应。pIgR是肠道黏膜中起免疫作用的重要功能蛋白[7]，能够介导多聚免疫球蛋白(pIgs)穿越上皮细胞进入肠腔内发挥免疫功能。pIgR结合 pIgs，将其从黏膜上皮运输到上皮细胞的顶端表面并分泌到管腔中，发挥免疫作用。同时pIgR中的分泌成分(SC)能够帮助sIgA分子避免被水解[8]。pIgR不仅仅作为免疫球蛋白的受体发挥作用，它还能直接产生免疫效应[9-10]。pIgR在上皮细胞中一般以两种形式存在：dIgA配位鍵和无dIgA配位鍵。在细胞外膜上这两种形式能通过蛋白裂解来释放sIgA或者自由分泌片[11]。其中的分泌成分是pIgR连接dIgA的胞外片段部分，不仅能够保护sIgA免受蛋白降解，还可以通过终止病毒复制的方式在细胞内中和某些病毒，直接杀灭病毒[12]。此外pIgR中的分泌成分通过与某些细菌成分结合，防止其对上皮细胞的入侵[13]。

丁酸是一种短链脂肪酸，也是机体微生物的主要发酵产物。近年来，针对丁酸的大量研究结果表明，丁酸在促进仔猪肠道发育，保护仔猪肠黏膜完整性，改善肠道黏膜免疫等均发挥重要作用[14-15]。徐菊美等[16]的研究表明，静脉灌注丁酸钠能显著增加仔猪结肠中sIgA的浓度。唐明红等[17]的研究结果也显示饲料中丁酸盐的添加能够增加育肥猪血清中IgA的含量。这些均表明丁酸能够改善肠道黏膜免疫。

本试验旨在阐明丁酸钠对猪回肠上皮细胞(IPI-2I)中pIgR表达的影响，并探讨其作用机制。结果发现丁酸钠能增加IPI-2I细胞pIgR的转录水平，该作用是受GPR109A介导的。丁酸钠和GPR109A有望为饲料添加剂中替抗药物的发掘和研究靶点的确认提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞IPI-2I细胞，猪回肠上皮细胞系，受赠于河南省农业科学院张改平院士实验室。

1.2 化学试剂丁酸钠粉末购于阿拉丁试剂有限公司，用ddH2O溶解后在超净台中过滤除菌，储存于-20℃冰箱，试验前再稀释到所需浓度。Trizol、RNA反转录体系、荧光定量PCR试剂盒等均购买于日本TaKaRa公司；BCA试剂盒购于Thermo公司；胎牛血清购于Hyclone公司； SDS凝胶试剂盒、脱脂奶粉、细胞裂解液、增强型ECL超敏发光液、Tween-20等均购于碧云天生物技术公司；D-MEM培养基和青-链霉素购自GIBCO公司；兔抗β-Tubulin、ERK1/2、JNK和Akt抗体购自CST公司。

1.3 IPI-2I细胞的复苏、培养与传代将IPI-2I细胞从液氮罐中取出，迅速解冻后接种于完全D-MEM培养基(含10%的胎牛血清)中培养。待细胞长到80%时，用预热好的0.25%胰酶消化30～60 s，离心后将细胞沉淀吹悬于完全D-MEM，吸取适量悬液接种于培养瓶中培养，观察细胞形态。

1.4 IPI-2I细胞的RNA提取培养皿中加入800 μL Trizol，静置数分钟，使细胞充分裂解脱落，然后移入无RNA酶的EP管，加入200 μL冷氯仿，上下颠倒20次充分混匀，静置10 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min。离心后吸取0.5 mL左右上层无色透明液体移入新的EP管，等比加入冷异丙醇，上下颠倒20次，4℃环境下静置15 min。4℃ 12 000 r/min离心15 min，得白色RNA沉淀。弃上清，加入1 mL 75%的酒精， 4℃ 12 000 r/min离心5 min，该步骤重复两次以清除残留异丙醇。离心后用移液枪吸走残留在管底的酒精，将离心管置于冰上在通风处晾干，直至管底白色沉淀变为无色透明状。加入20 μL冷的DEPC水，手指轻弹振荡至沉淀溶解，于-80℃超低温冰箱中保存。

1.5 IPI-2I细胞中pIgR mRNA和GPR109A mRNA表达水平的检测实时荧光定量PCR法 (qPCR) 用于检测GPR109A mRNA和pIgR mRNA在不同浓度丁酸钠处理IPI-2I细胞24 h后的表达水平变化。提取细胞总RNA然后反转录为cDNA，荧光染料、上下游引物和cDNA组成20 μL的体系，振荡混匀并离心后进行qPCR。每个试验组设置3个重复孔。引物序列如表1。在加样过程中注意不要产生气泡，减少试验误差。

表1 引物序列与扩增产物长度

1.6 IPI-2I细胞中信号通路相关分子的检测2 mmol/L丁酸钠处理IPI-2I细胞，处理时间分别为0，5，15，30，60 min。将处理过的细胞用细胞刮刀刮下来，置于EP管内，离心得细胞沉淀。使用细胞裂解液提取细胞总蛋白，并使用BCA试剂盒检测蛋白浓度，用酶标仪在570 nm的条件下测吸光值。将蛋白分装，并通过免疫印迹试验检测细胞内AKT、ERK1/2和JNK信号通路激活情况。

1.7 ERK、AKT和JNK通路阻断后对pIgR mRNA表达的影响选择状态良好的细胞接种于60 mm的培养皿中，待细胞长到70% 左右时，分别使用10 μmol/L 的AKT抑制剂(MK2206)、ERK1/2抑制剂(U0126)及JNK抑制剂(SP600125)预处理2 h，丁酸钠作用24 h后检测细胞中pIgR的表达水平。共分5个试验组：NT组、丁酸钠组、MK2206+丁酸钠组、U0126+丁酸钠组和SP600125+丁酸钠组。提取5个试验组的细胞总RNA并反转录为cDNA，qPCR检测pIgR的表达水平。

1.8 阻断GPR109A对PIGR mRNA表达的影响细胞接种于直径为60 mm的培养皿中，待密度达到60%左右时，使用GPR109A-ShRNA(MOI 20)慢病毒进行细胞转染24 h，再用2 mmol/L丁酸钠刺激细胞24 h，提取细胞总RNA，反转录为cDNA，进行qPCR检测GPR109A是否介导了丁酸钠对IPI-2I细胞中pIgR表达的调控作用。

2 结果

2.1 丁酸钠能增强IPI-2I细胞中pIgR的表达水平分别用0.0,1.0,1.5,2.0 mmol/L的丁酸钠处理IPI-2I细胞，24 h后提取细胞总RNA以观察pIgR mRNA的表达情况。结果显示，相较于对照组，2.0 mmol/L丁酸钠能显著增强IPI-2I细胞中pIgR的表达水平(图1)，故本试验最终选用2.0 mmol/L作为丁酸钠的工作浓度。

2.2 丁酸钠激活GPR109A用不同浓度(0.0,1.0,1.5,2.0 mmol/L) 的丁酸钠处理IPI-2I细胞24 h，观察GPR109A的激活情况。相较于空白对照组，丁酸钠可促进IPI-2I细胞GPR109A的表达，且呈剂量依赖性。在2.0 mmol/L时，有显著性差异(图2)。

2.3 GPR109A介导丁酸钠对IPI-2I细胞中pIgR表达的调控为了沉默GPR109A受体，使用GPR109A-ShRNA 慢病毒转染IPI-2I细胞24 h，添加2.0 mmol/L丁酸钠继续作用24 h。结果显示，相较于丁酸钠组，GPR109A-ShRNA 慢病毒的干扰能够显著降低GPR109A的表达，说明受体沉默成功(图3)。与此同时，相对于丁酸钠组，GPR109A-ShRNA 慢病毒干扰阻断了丁酸钠对pIgR表达的促进作用(图4);表明丁酸钠增加pIgR mRNA表达的作用是由GPR109A介导的。

图2 丁酸钠(NaB)促进IPI-2I细胞GPR109A的表达(n=3)

图3 GPR109A-ShRNA 慢病毒显著降低GPR109A的表达 注：(n=3；**,##.P<0.01,*与NC比，#与NaB比;NaB.丁酸钠。下同

2.4 2% mmol/L丁酸钠促进ERK1/2和AKT通路的活化用2% mmol/L丁酸钠处理IPI-2I细胞0,5,15,30,60 min后，提取细胞总蛋白，并利用免疫印迹法检测细胞内ERK1/2、AKT和JNK通路的活化情况。结果表明，丁酸钠处理30 min后，AKT通路活化最强；丁酸钠处理90 min后，ERK1/2通路活化最强。以上结果显示丁酸钠能够增强AKT和ERK1/2通路的活化(图5)。

图4 丁酸钠(NaB)通过GPR109A发挥对pIgR表达的促进作用 ****,####.P<0.000 1。下同

2.5 丁酸钠通过ERK1/2调控IPI-2I细胞中pIgR的表达用10 μmol/L 的MK2206、U0126 和SP600125预处理细胞2 h，它们分别是AKT、ERK1/2和JNK信号通路的特异性抑制剂。随后再用丁酸钠作用24 h，检测IPI-2I细胞中pIgR的表达量。相对于对照组，丁酸钠组IPI-2I细胞中pIgR的表达量显著增加，而ERK1/2 抑制剂(U0126)的预处理可逆转该作用， AKT抑制剂(MK2206)和JNK抑制剂(SP600125)的预处理对丁酸钠导致的pIgR表达增高无抑制作用(图6);以上结果表明丁酸钠通过ERK1/2的活化来增加pIgR的表达。

3 讨论

pIgR在黏膜免疫系统中有着举足轻重的地位。pIgR参与黏膜转运和固有免疫[18]，在将IgA从固有层转运到黏膜表面的过程中也发挥着一定的作用[10]。pIgR直接参与sIgA的形成，其可被酶切从而释放其胞外区，即分泌片(SC)。而SC能结合dIgA形成sIgA，使其更为稳定的发挥作用，免受蛋白酶降解。已证实游离的SC和sIgA有助于以新的方式调节对病原体的天然的“非特异性”反应，同时限制炎症反应的发生发展[19]。

丁酸盐除了作为细胞重要的能量来源外，还具有直接的免疫调节作用[20]。研究发现,在断奶仔猪日粮中添加丁酸钠可抑制肥大细胞的活化从而抑制TNF-α和IL-6的mRNA 表达,其机制是抑制JNK信号通路的磷酸化水平[21]。而TIAN 等[22]研究结果表明,丁酸钠通过显著下调TNF-α、IL-1β和IL-6 等促炎因子的mRNA 表达,并上调IL-10 等抗炎细胞因子的mRNA 表达,从而缓解体内炎症反应。XU等[23]用丁酸钠溶液灌胃初生仔猪,结果发现丁酸钠通过下调仔猪回肠中HDACs 的表达,抑制IL-6、IL-8 和INF-γ 等促炎因子的mRNA 表达。在本试验中，我们重点观察了丁酸钠处理对猪回肠上皮细胞系中与黏膜免疫相关蛋白pIgR表达的影响。

图5 丁酸钠(NaB)能够增强AKT和ERK1/2活化

图6 丁酸钠(NaB)通过ERK1/2调控IPI-2I细胞中pIgR的表达

GPR109A最早被证明介导了烟酸降低血脂的作用，但近期报道证实GPR109A与机体免疫调节也息息相关。已有报道证实，丁酸作为肠道内细菌消化纤维素的产物，在结肠中可经由GPR109A抑制肠道内炎症，抑制肠道内巨噬细胞和DC细胞的活化，并引起Treg细胞的分化和IL-10的产生，从而降低炎症程度和减少结肠癌的发生[24]。我们前期研究也发现，丁酸激活GPR109A能够显著降低断奶应激造成的仔猪腹泻比率及严重程度，显著降低结肠部位炎性细胞因子的表达[14]；通过对人工化学诱导的GPR109A-/-鼠和WT鼠结肠炎模型的观察，发现GPR109A-/-鼠具有更加严重的肠道炎症和肠道通透性的提高；利用丁酸激活GPR109A，抑制了NF-κB以及AKT的磷酸化，可以显著降低LPS诱导的巨噬细胞IL-1、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子的分泌，从而对缓解TNBS诱导的炎症性肠病(IBD)小鼠模型的腹泻症状[25]。因此我们合理假设，丁酸钠对pIgR表达的促进作用也是由GPR109A介导的。我们使用GPR109A-ShRNA慢病毒转染细胞，成功干扰受体，发现GPR109A的缺失或沉默导致丁酸钠对pIgR表达的增强作用受到了显著抑制，证明丁酸钠对pIgR mRNA表达的调控作用依赖于GPR109A。

研究表明，Gi型G蛋白偶联受体的激活会导致ERK1/2 信号通路的激活[26]。我们之前的研究结果也表明，BHBA在激活GPR109A的同时也伴随着ERK1/2通路的活化[27]。在本试验中，我们使用蛋白印迹试验检测丁酸钠对IPI-2I细胞中信号通路的激活情况。结果表明，丁酸钠处理显著增强了IPI-2I细胞中ERK1/2和AKT通路的活化。为了进一步研究丁酸钠对pIgR表达影响过程中ERK1/2和AKT通路发挥的作用，我们使用特异性抑制剂阻断通路，发现ERK1/2通路的阻断显著减少丁酸钠处理导致的pIgR mRNA表达的增强。而阻断JNK通路和AKT通路并不能对丁酸钠诱导的pIgR mRNA表达的升高产生显著影响。以上结果表明，ERK1/2通路在丁酸钠诱导的pIgR表达增加中发挥着重要作用。