占心佾，甘海宁，李钰婷，陈玉兴，李茹月，黄丹娥

（广州中医药大学第五临床医学院，广东省中医药工程技术研究院，广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095）

免疫是人体的一种生理功能，依靠该功能区分“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质或自身产生的肿瘤细胞等，以维持人体的健康。免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫活性物质组成。当免疫功能过低时，就会出现免疫缺陷综合征，产生各类疾病。目前临床用于治疗免疫低下导致相关疾病的药物并不多，大都只能通过增强细胞或体液免疫的某一靶点产生效应，但机体免疫系统及其复杂，任何针对靶点的免疫增强药物，临床疗效均不理想［1］。中医学认为免疫力相当于人体正常功能的“正气”，是针对导致疾病的病邪而言的［2］。为调节人体免疫机能，中医学提出扶正与祛邪两大治疗法则，对于过亢的免疫反应多采用以祛邪为主的治则，达到“邪去则正安”；对于免疫反应低下者，多采用扶正治则为主，达到“扶正以祛邪”［3］。玉屏风散是中医扶正固本的经典名方，由黄芪、白术和防风三味药组成，有扶正止汗、祛邪御风等功效［4］。目前临床广泛用于免疫调节、哮喘、荨麻疹等过敏反应。本文以玉屏风颗粒作为研究对象，探索其对环磷酰胺致免疫缺陷大鼠的免疫调节作用。

1 材料

1.1 动物 SD 大鼠购自广东省医学实验动物中心，实验动物合格证号44007200053987。实验环境为广东省中医药工程技术研究院SPF 级动物实验室，设施使用许可证号SYXK（粤）2015-0059。

1.2 试剂与药物 玉屏风颗粒（广东环球制药有限公司，批号161213）；乌苯美司（西安万隆制药股份有限公司，批号170308）；虚汗停（广州白云山奇星药业有限公司，批号17048）。大鼠白细胞介素4 酶联免疫检测试剂盒、大鼠免疫球蛋白A 酶联免疫检测试剂盒、大鼠免疫球蛋白G酶联免疫检测试剂盒、大鼠干扰素γ 酶联免疫检测试剂盒均购于天津安诺瑞康生物技术有限公司，批号分别为384181016、347181016、349181016、366181016。水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，分析纯，批号2016092901）；环磷酰胺（德国Baxter Oncology GmbH 公司，批号8D232A）。

1.3 仪器 JJ3000-动物电子秤（美国G＆G 公司）；BS224S电子分析天平（德国Sartorius 公司）；3K30 离心机（美国Sigma 公司）；Varioskan Flash 全波长多功能酶标仪（美国Thermo 公司），FC500 流式细胞 仪（美国 Beckman Coulter 公司）。

2 方法

2.1 造模、分组及给药 70 只大鼠随机分为正常组、模型组、乌苯美司 组（2.7 mg／kg）、虚汗停颗粒组（5.4 g／kg）及玉屏风颗粒高、中、低剂量组（5.4、2.7、1.35 g／kg）。采用环磷酰胺建立免疫缺陷模 型［5-6］，按40 mg／kg剂量腹腔注射环磷酰胺，首次加倍，隔日1 次，连续4 次；正常组腹腔注射等剂量的生理盐水。大鼠腹腔注射环磷酰胺4 次后灌胃给药，给药体积为10 mL／kg，模型组和正常组给予等量生理盐水，连续1 个月。给药结束前一天禁食12 h，末次给药1 h 后取血。

2.2 检测大鼠血液中的淋巴细胞亚群比例、Treg 细胞比例 采用流式细胞术。（1）取50 μL 血样于各管中，加CD3＋、CD25＋抗体各1 μL，CD4＋抗体1.25 μL，涡旋后避光孵育25 min，加红细胞裂解液400 μL 后，避光10 min；（2）于1 500 r／min 离心15 min，去上清；（3）加1 mL 工作液，振匀，室温避光1 h；（4）加2 mL Permeabilization Buffer，离心后去上清；（5）用100 μL Permeabilization Buffer 重悬细胞；（6）加Foxp3 ＋抗体1 μL，室温避光30 min；（7）加2 mL Permeabilization Buffer，离心5 min 去上清；（8）加500 μL 鞘液，充分混匀，上机检测。

2.3 测定血清中IL-4、IFN-γ、IgG、IgA 水平 用ELISA法检测。（1）根据试剂盒说明书于96 孔板中加入等量的血清样品，并依次加入25 μL 生物素标记抗体；（2）在标准孔及待测样品孔中分别加入100 μL 辣根过氧化物，充分混匀，37 ℃温箱中孵育60 min，清洗液洗板5 次；（3）依照次序于每个孔中加入TMB Ⅰ50 μL，再加入TMB Ⅱ50 μL，充分混匀，室温下避光反应20 min；（4）反应后每孔加入终止液50 μL，充分反应，于450 nm 下读取吸光度值。

2.4 统计学分析 应用SPSS 22.0 统计软件进行统计，计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差分析和两样本均数比较采用t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析。组间比较，方差齐时采用SNK 法，方差不齐时采用Dunnett’s T3 法。

3 结果

3.1 玉屏风颗粒对大鼠血液淋巴细胞亚群的影响 如表1、图1 所示，与正常组比较，模型组CD3＋、CD3＋CD8＋比例差异无统计学意义（P＞0.05），CD3＋CD4＋、CD3＋CD4＋／CD3＋CD8＋比例降低（P＜0.05）；与模型组比较，虚汗停组CD3＋CD4＋／CD3＋CD8＋比例升高（P＜0.05），而乌苯美司组、玉屏风颗粒组CD3＋CD4＋、CD3＋CD4＋／CD3＋CD8＋比例升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 玉屏风颗粒对大鼠血液淋巴细胞亚群的影响（±s，n＝10）

表1 玉屏风颗粒对大鼠血液淋巴细胞亚群的影响（±s，n＝10）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 玉屏风颗粒对大鼠血液Treg 细胞的影响 如表2、图2 所 示，与正常组比较，模型组CD4＋CD25＋、CD25＋FOXP3＋、CD4＋FOXP3＋比例降低（P＜0.01）；与模型组比较，乌苯美司组CD4＋CD25＋比例升高（P＜0.05），而虚汗停组、玉屏风颗粒组3 个比例均升高（P＜0.01）。

表2 玉屏风颗粒对大鼠血液Treg 细胞的影响（±s，n＝10）

表2 玉屏风颗粒对大鼠血液Treg 细胞的影响（±s，n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 玉屏风颗粒对大鼠血清IL-4、IFN-γ、IgG、IgA 水平的影响 如表3 所示，与正常组比较，模型组IL-4、IgA 水平差异无统计学意义（P＞0.05），但分别呈上升、降低趋势，IgG 水平下降，IFN-γ 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，虚汗停组、玉屏风颗粒组逆转IgG、IFN-γ 水平（P＜0.01），而乌苯美司组仅IFN-γ 水平下降（P＜0.01）。

表3 玉屏风颗粒对大鼠血清IL-4、IgG、IgA、TNF-γ 水平的影响（±s，n＝10）

表3 玉屏风颗粒对大鼠血清IL-4、IgG、IgA、TNF-γ 水平的影响（±s，n＝10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

图2 各组大鼠血液中Treg 细胞流式细胞仪检测的结果

4 讨论

中医认为，免疫疾病主要与先天禀赋不足、外感六淫之邪、营卫气血失调、腑脏功能紊乱、痰浊瘀血内生等因素密切相关，故确定“扶正祛邪”这一治则［7］。玉屏风散可益气固表、祛风御邪，临床多用于治疗感冒、调节免疫力、减少过敏反应的发生，故本实验选择该方进行研究。

环磷酰胺是一种细胞毒性药物，具有较强的免疫抑制作用，体现在抑制巨噬细胞活性、抑制T 细胞增殖及抗体分泌等方面［8］。免疫调节以T 淋巴细胞介导的细胞免疫为主，T 淋巴细胞又可分为辅助性T 细胞和细胞毒性T 细胞，主要表面标志分别是CD4 和CD8，CD4＋／CD8＋在维持机体免疫平衡中有重要意义［9-10］；CD4＋细胞亚群在体内的作用机制复杂，其比例升高时免疫增强，对炎症介质的释放也有影响［11-12］；有Th1、Th2、Th3、Th17、Tfh 等，其中Th1细胞可促进IFN-γ 的产生，Th2 细胞分泌的IL-4 在促进B细胞和肥大细胞增殖、发挥巨噬细胞的功能中均有重要作用［13-14］。调节性T 细胞是一类控制体内自身免疫反应性的T 细胞亚群，其中自然调节性T 细胞主要为CD4＋CD25＋Treg，除表达CD4、CD25 分子外，其特征标志为其高表达转录因子FOXP3［15-17］。

本实验显示，玉屏风颗粒对维持机体免疫平衡、提高免疫力有显著效果；与模型组比较，玉屏风颗粒组大鼠血清中IgG 水平升高、IFN-γ 水平降低，且血液中CD4＋、CD8＋、CD4＋CD25＋、FOXP3＋细胞比例均有上升趋势，其作用机制可能是提升CD4＋、CD8＋、调节性T 细胞比例，重新平衡和提高淋巴细胞、调节性T 细胞水平，从而维持Th1 和Th2 细胞的平衡；抑制IFN-γ 分泌，促进IgG 产生，进而达到调节免疫平衡、增强免疫力的目的。