孙文杰，陈亚峰，李红昌，刘 欢，李 劼，曹亦军，陈 腾，奉典旭

（上海中医药大学附属普陀医院，上海 200062）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是胰腺的急性炎症反应，因其往往会影响多个器官功能，现在越来越多专家认为AP 是一种全身性疾病，并且有20%～30%的AP 患者病情恶化为重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）［1］，造成多个器官的功能障碍。肝损伤是SAP 常见的并发症之一，临床回顾性观察分析显示［2］，肝衰竭是SAP 患者死亡的主要影响因素之一，因此对SAP 合并肝损伤的防治有着较大意义。

程序性坏死作为一种可以引发炎症反应的细胞死亡方式，其主要是在TNF-α 诱导下，由受体相互作用蛋白3（receptor-interacting protein3，RIP3）进行调控［3］。近年来研究表明，程序性坏死主要执行蛋白RIP3 在急性肝损伤中也起着重要作用［4-5］，其可以通过多种途径加剧肝损伤。

大承气汤是中医经典的通里攻下方剂，源自汉代《伤寒论》，由大黄（君）、芒硝（臣）、枳实（佐使）、厚朴（佐使）组成，主要用于治疗一些腹部疼痛性疾病。大承气汤对A P 的治疗作用已在临床及基础研究中得到验证，并且基于该方临床还研究出一些类方［6］。近年来也有专家探讨大承气汤或大黄主要成分在防治SAP 引起肝损伤中的作用［7-8］，进一步扩大了其应用范围。课题组前期发现，在SAP 动物及细胞模型中，大承气汤可以通过干预胰腺腺泡细胞程序性坏死来减轻胰腺损伤，近期研究发现，大承气汤在防治SAP 加重过程中，也可以通过抑制RIP3-MCP1 信号通路减轻SAP 合并的肝损伤。

1 材料

1.1 动物 40 只健康雄性C57BL／6 小鼠，体质量（18±2）g，SPF 级，8 周龄，购于上海斯莱克公司，生产许可证号SCXK（沪）2017-0002。

1.2 药物 大承气汤由生大黄（600 g）、芒硝（300 g）、枳实（600 g）、厚朴（1 200 g）组成，以上药材均购于上海康桥中药饮片有限公司，经上海中医药大学中药学院崔波老师鉴定为正品，并经甲醇超声提取60 min，其具体制作方法同Pan 等［9］报道，获得大承气汤固体颗粒246 g（得率9.11%），最终用生理盐水分别配置成0.25、0.5、1 g／mL。

1.3 试剂 雨蛙素（批号SLBS3844）、脂多糖（批号L-2800）购自美国Sigma 公司；所有ELISA 试剂盒，包括淀粉酶（批号ab36345）、TNF-α（批号ab35884）、ALT（批号E4324）、AST（批号E4320）均购自杭州联科生物技术股份有限公司；RIPA 裂解液（中）（批号P0013C）、PMSF（批号ST506）、蛋白酶抑制剂（批号P1031）、磷酸酶抑制剂（批号P1082）均购上海碧云天生物科技有限公司；所有抗体，包括RIP1（批号ab42125）、RIP3（批号ab56164）、TNF-α（批号ab6671）、MCP1（批号ab9669）、GAPDH（批号ab181602）抗体均购自英国Abcam 公司。

1.4 仪器 酶标仪、双向电泳仪、PCR 基因扩增仪（美国Bio-Rad 公司）；石蜡组织块包埋机、病理切片机（德国Leica 公司）；Real time PCR 扩增仪（美国 Applied Biosystems 公司）；WB 显影仪（上海培清科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分组及给药 将小鼠随机分为正常组、模型组及大承气汤组低、中、高剂量（5、10、20 g／kg），每组8只（剂量使用按小鼠体表面积剂量换算法获得）。各组小鼠造模前12 h 及造模后予以禁食（自由饮水），正常组腹腔内注射生理盐水0.1 mL／10 g，共6 次（间隔时间1 h）；模型组腹腔连续6 次注射雨蛙素（50 μg／kg），最后2 次联合注射脂多糖（7.5 mg／kg），具体方法同Chen 等［10］报道；大承气汤组在模型组的基础上，于造模前30 min 及造模后3、6 h 用不同剂量大承气汤灌胃3 次，给药体积为20 mL／kg，并于造模后10 h 采集样本。

2.2 血清炎症因子检测 实验结束后小鼠摘除眼球取血，并迅速处死，分离上层血清后根据ELISA Kit 说明书，分别检测淀粉酶、TNF-α、ALT、AST 水平。

2.3 胰腺、肝脏组织病理变化观察 取各组小鼠胰腺、肝脏组织，通过10%中性甲醛固定，梯度脱水后用二甲苯透明，用石蜡包埋，进行切片（厚度5 μm），然后HE 染色，最后在光学显微镜下观察胰腺及肝组织病理变化，分别根据其病变程度（水肿、炎症及坏死等）进行评分，具体病理评分标准分别参考Schmidt［11］、Camargo［12］报道。

2.4 肝组织RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白及mRNA 表达检测 剪取适量小鼠肝组织，分别提取总蛋白及RNA，BCA 蛋白定量、RNA 浓度检测后，根据相应试剂盒操作说明进行Western blot 和RT-PCR 法以检测相应蛋白和基因表达情况。引物由Sangon Biotech 公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

3 结果

3.1 大承气汤对血清淀粉酶、TNF-α、ALT、AST 的影响 由表2 可知，模型组小鼠血清淀粉酶、TNF-α、ALT、AST 水平较正常组升高（P＜0.01），血清指标表现出SAP合并肝损伤模型；在低、中、高大承气汤组中，这些指标均有一定的好转（P＜0.01），并且在高剂量效果最明显。

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表2 大承气汤对血清淀粉酶、TNF-α、ALT、AST 水平的影响（±s，n＝8）

表2 大承气汤对血清淀粉酶、TNF-α、ALT、AST 水平的影响（±s，n＝8）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

3.2 大承气汤对SAP 小鼠胰腺及肝脏病理的影响 由图1、表3 可知，正常组小鼠胰腺、肝组织叶间隙分布均匀，无水肿及炎性渗出；模型组小鼠胰腺及肝组织叶间隙扩张，小叶内弥散炎性细胞，病理评分均高于正常组（P＜0.01）；大承气汤组小鼠可不同程度减轻胰腺和肝脏的病理损伤（P＜0.01），并且在高剂量下效果最明显。

图1 各组小鼠胰腺及肝脏HE 染色（×200）

表3 各组小鼠胰腺及肝脏病理评分（±s，n＝8）

表3 各组小鼠胰腺及肝脏病理评分（±s，n＝8）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

3.3 大承气汤对肝脏RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白表达的影响 由图2、表4 可知，与正常组比较，模型组RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，大承气汤各组可降低肝脏RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白表达（P＜0.01），且剂量越高效果越明显，而RIP1 蛋白表达未见差异（P＞0.05）。

图2 各组肝脏RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白表达

表4 大承气汤对RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白表达的影响（±s，n＝8）

表4 大承气汤对RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白表达的影响（±s，n＝8）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

3.4 大承气汤对肝脏RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 mRNA表达的影响 表5 显示，与正常组比较，模型组RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 mRNA 表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，大承气汤组RIP3、TNF-α、MCP1 mRNA 表达降低（P＜0.01），且剂量越高效果越明显，而RIP1 mRNA 表达未见差异（P＞0.05）。

表5 大承气汤对RIP1、 RIP3、 TNF⁃α、 MCP1 mRNA 的影响（±s，n＝8）

表5 大承气汤对RIP1、 RIP3、 TNF⁃α、 MCP1 mRNA 的影响（±s，n＝8）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

4 讨论

因胰腺与肝脏的解剖位置毗邻，SAP 发生时胰腺所产生的炎症介质可以通过门静脉直接损伤肝细胞，继而肝脏产生更多的炎症因子参与到SAP 相关的局部和全身炎症反应中，使得肝损伤成为AP 发展为SAP 及死亡的重要因素［13］。研究表明［13-14］，在SAP 早期阶段，肝脏可以因刺激而产生TNF-α，而TNF-α 作为促进细胞死亡的主要炎症介质，在不同的模型中可以分别启动RIP1 调控的细胞凋亡或RIP3 调控的细胞程序性坏死。研究也表明［14-15］，程序性坏死对AP 的轻重程度有重要影响，在雨蛙素诱导的AP模型中，RIP3 基因过表达往往引起胰腺腺泡细胞坏死，并且RIP3 基因的缺失可以降低AP 的严重程度，而RIP1 作为介导凋亡、坏死必须参与的基因，往往在轻症AP 中高表达，在SAP 中表达降低。

近年来研究表明［16-17］，程序性坏死在肝损伤模型中也发挥着一定的作用，正常肝脏组织表达RIP1 与RIP3 极低，我们的实验结果与相关文献报道的相一致，并且在不同的模型中RIP1 与RIP3 对肝损伤的作用不同。M Deutsch 研究发现［4］，在不同的肝损伤模型中，阻断RIP3 均可一定程度的减轻肝损伤，而RIP1 的阻断则会加重肝损伤；Wei S等［5］报道RIP3 缺陷可通过ROCK1 调节TLR4-NF-κB 信号通路，导致巨噬细胞炎症减少，以此减轻肝损伤。本实验初步证实程序性坏死关键基因RIP3 在雨蛙素联合脂多糖诱导的SAP 并发肝损伤小鼠发病机制中有着重要作用，其机制可能是TNF-α 启动的RIP3-MCP1 炎症信号通路，进而引起ALT、AST 等促炎因子介导机体免疫应答，引起一系列炎症反应，这也提示药物若能在早期干预，可通过有效阻止RIP3-MCP1 信号通路激活来避免或减轻SAP 合并的肝损伤。

另外，值得注意的是，虽然有研究显示大黄可引起一定的肝损伤［19］，但也有学者基于代谢组学［20］，发现在肝纤维化大鼠模型中，大黄又能减少ALT 及AST 含量，表明了大黄对于肝功能的双向调节作用［21］。

本研究显示，在SAP 合并肝损伤模型中，RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 基因显著上调，而大承气汤能通过抑制肝脏RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白及mRNA 表达，下调血清淀粉酶、TNF-α、ALT、AST 水平，其机制可能是通过调控RIP3-MCP1 信号通路进而抑制炎性细胞因子分泌，最终减轻SAP 小鼠模型的肝损伤程度。但大承气汤成分繁杂，其在不同模型中对SAP 并发肝损伤的作用靶点也可能会有不同，并且RIP3-MCP1 信号通路在临床中的作用也仍需进一步验证，所以大承气汤在治疗SAP 合并肝损伤中的研究仍有待深入探索。