宋宇尘，雷 爽*，韩新民，袁海霞，周荣易，刘 睿

（1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029； 2.南京中医药大学，江苏 南京 210023； 3.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000）

注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）为儿童期发病特别是学龄期儿童常见的心理行为障碍性疾病，其主要特征是与年龄不相符的注意力不集中、多动、冲动［1］。本病与成年高犯罪率有关，持续到成年的ADHD 可伴随更加严重的心理行为障碍且更难治疗，严重影响患者的健康成长、家庭和睦及社会和谐。ADHD 的发病机制尚未明确，学术界认可的假说中“多巴胺（dopamine，DA）缺陷理论”的接受度和讨论度最高［2］。哌甲酯和托莫西汀为当前治疗ADHD 的一线药物，但因其不良反应使接受度较低，限制了广泛应用。中医药治疗ADHD 因临床疗效确切、远期疗效好、不良反应少，近年来受到患儿家长的肯定和欢迎。南京中医药大学韩新民教授的经验方安神定志灵是依据多部中医古代儿科著作相关理论及30 多年治疗儿童多动症的经验创制而成，临床对照研究证实了安神定志灵对ADHD 心肝火旺证的积极作用［3］。课题组前期研究表明复方安神定志灵能够升高SHR大鼠前额叶与纹状体DA 水平，调节DA 受体功能［4-6］。但DA 系统十分复杂，DA 的合成、清除等环节障碍均可能导致ADHD 的发生。课题组前期对SHR 大鼠脑突触体DA 合成相关因子进行检测，发现安神定志灵可以通过控制DA合成速度发挥对核心症状的疗效［7］。前额叶皮质在注意力和工作记忆的功能至关重要［8］，基于以上前提，为进一步探讨安神定志灵的作用机制，课题组以前额叶皮质DA 合成关键因子酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）及清除关键因子多巴胺转运体（dopamine transporter，DAT）为切入点，探究经验方安神定志灵的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）大鼠40 只，雄性WKY 大鼠8 只，雄性SD 大鼠8 只，3 周龄，体质量（76.7±7.3）g，生产许可证SCXK（京）2012-0001，动物饲养设施许可证号SYXK（苏）2014-0001，动物伦理审查批准编 号ACU170803。大鼠自由饮食进水，适应性饲养7 d［9］。

1.2 药物 所用同批次中药购自南京中医药大学国医堂中药房，且由南京中医药大学中药资源学教研室主任巢建国教授鉴定为正品，全方12 味中药饮片药用部位及产地、批号见表1。中药煎剂根据前期研究的水提取方法制备，以保证药物有效成分的足量析出［10］。采用负压旋转蒸发仪将药液浓缩至1.78 g／mL（高剂量），用生理盐水把浓缩药液稀释为0.45、0.89 g／mL（低、中剂量）。盐酸托莫西汀胶囊（择思达，strattera，美国LILLY DEL CARIBE Inc 公司，进口药品注册证号H20110150，40 mg／片），加生理盐水配置成0.67 mg／mL 混合液，4 ℃下保存备用。每日恢复至室温并摇匀后，灌胃使用。

1.3 仪器 MM400 球磨仪（德国Retsch 公司）；5427R 离心机（德国Eppendorf 公司）；Shandon 全自动染色机（美国Thermo 公司）；Trans-Blot SD 型蛋白半干转印仪、Chemi-Doc MP 型凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；Tissue-Tek-VIP6 型全自动真空组织脱水机（日本Sakura 公司）；Histostar 包埋机、Finesse E＋手动切片机（美国Thermo 公司）；Light Cycle 型DNA 荧光定量分析仪（瑞士Roche 公司）；Quantsdudio7 型荧光PCR 仪（美国Life 公司）；荧光显微镜（日本Nikon 公司）。

表1 安神定志灵药物组成

1.4 试剂 β-actin 抗体（英国Abcam 公司，货号ab5694）；Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody（英国Abcam公司，货号ab112）；Anti-Dopamine Transporter antibody（英国Abcam 公司，货号ab111468）；BCA 试剂盒（美国Thermo 公司，批号23227）；ECL 化学发光底物（美国Thermo 公司，批号32109）；PBS 缓冲液（每1 L 中含8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4，pH 调至7.4）；Trizol、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司，货号9109、RR036A、RR820A）。1.5 Real-time PCR 引物合成 引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表2。

表2 引物序列

2 方法

2.1 给药、分组 将40 只SHR 大鼠根据开场实验总运动距离以随机数字表法分为5 组，每组8 只，即模型组，择思达组（0.045 mg／kg），安神定志灵低、中、高剂量组（6.7、13.4、26.7 g／kg）（安神定志灵中剂量等同于临床等效剂量），另将8 只WKY 大鼠设为正常组1，8 只SD 大鼠设为正常组2，用药剂量根据体表面积法换算而得［11］。适应性饲养后每日早8：00 称重，各组大鼠灌胃体积均为1.5 mL／100 g，正常组1、2 及模型组均用生理盐水灌胃，2 次／d，持续28 d。

2.2 样品采集 末次给药后禁食12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，处死动物，剥开颅骨，取脑，快速于冰上分离前额叶，保存至－80 ℃冰箱。

2.3 Western blot 法检测前额叶皮质TH、DAT 蛋白表达 前额叶组织50～80 mg 加入RIPA 裂解混合液（含PMSF）1 mL，于球磨仪裂解30 min，参考课题组前期实验步骤进行实验操作［7］。一抗稀释度分别为兔源TH 一抗（1∶200）、兔源DAT 一 抗（1∶1 000）、羊抗兔二 抗（1∶3 000），曝光。Image Lab 5.1 软件分析条带灰度值，以β-actin 为内参，目的蛋白灰度值与内参灰度值的比值表示其相对表达量。

2.4 Real-time PCR 检测前额叶皮质TH、DATmRNA 表达 按照实验操作步骤提取前额叶总RNA，分析纯度后逆转录，检测浓度，96 孔板加样，离心10 min，注意避光，放入荧光PCR 仪进行实时荧光定量PCR 实验，扩增条件95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，循环40 次；反应条件37 ℃15 min，85 ℃5 s，描绘溶解曲线，重复3 次，对RQ值进行统计分析。

2.5 免疫荧光法检测前额叶皮质TH、DAT 表达 每组随机选取大鼠3 只，末次给药后禁食12 h，麻醉后分离心脏，在右心耳剪一小口，从心尖用4%多聚甲醛溶液灌注固定，灌注结束后剥离颅骨，取出脑组织，置4 ℃、4%多聚甲醛中固定12 h 以上，于高浓度蔗糖溶液中沉底。石蜡切片脱蜡至水，用PBS 洗3 次，5 min／次，抗原修复，用3%H2O2（溶剂为PBS）溶液室温封闭10 min，双蒸水洗涤，PBS 洗1 次，除去多余液体，滴加一抗，室温下孵育1 h，PBS 洗3 次，5 min／次，滴 加1∶200 稀释的 Alexa Fluor488、594 荧光标记二抗体，室温避光作用1 h，倾去多余的二抗，PBS 缓冲液漂洗2 次，5 min／次，加入DAPI室温作用5～10 min，抗淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察。

2.6 统计学分析 采用Graphpad 6 统计软件，采用单因素方差分析进行组间比较，分别与正常组1、正常组2、模型组、择思达组进行两两比较，采用LSD-t、Dunett-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠前额叶皮质TH、DAT 蛋白表达 灌胃28 d后，与正常组1、2 比较，模型组TH 蛋 白表达降低（P＜0.05），DAT 蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，择思达组、复方安神定志灵低剂量组TH 蛋白表达升高（P＜0.05），择思达组、复方安神定志灵中剂量组DAT蛋白表达降低（P＜0.05）。见图1。

图1 复方安神定志灵对大鼠前额叶皮质TH、DAT 蛋白表达的影响（n＝8）

3.2 各组大鼠前额叶皮质TH、DATmRNA 表达 灌胃28 d后，与正常组1、2 比较，模型组THmRNA 表达水平降低（P＜0.05），DATmRNA 表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，择思达组、复方安神定志灵低剂量组THmRNA 表达水平升高（P＜0.05），择思达组、复方安神定志灵中剂量组DATmRNA 表达水平降低（P＜0.05）。见图2。

图2 复方安神定志灵对大鼠前额叶皮质TH、 DAT mRNA 表达的影响（n＝8）

3.3 各组大鼠前额叶皮质TH、DAT 蛋白表达 灌胃28 d后，与正常组1、2 比较，模型组TH 蛋白表达降低（P＜0.05），DAT 蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，择思达组及复方安神定志灵低剂量组TH 蛋白表达升高（P＜0.05），择思达组及复方安神定志灵中剂量组DAT 蛋白表达降低（P＜0.05），两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3～5。

图3 复方安神定志灵对大鼠前额叶皮质TH、DAT 蛋白表达的影响（n＝8）

图4 复方安神定志灵对SHR 大鼠前额叶TH 阳性细胞表达的影响（×400）

图5 安神定志灵对SHR 大鼠前额叶DAT 阳性细胞表达的影响（×400）

4 讨论

随着社会经济的发展、对儿童教育要求的提高，ADHD越来越受到家庭、学校和社会的重视，推进了本病的研究。ADHD 病因病理尚未明确的现状和其动物模型问题互为因果，是国内外学者广泛面对的难题，阻碍了本病的研究进展。SHR 大鼠是迄今国内外围绕ADHD 基础研究认可度最高的动物模型［12］，SHR 大鼠由WKY 大鼠培育而来，在5周龄前无高血压的混杂效应，而具有ADHD 的主要行为学表现。因ADHD 是根据症状诊断的疾病，SHR 行为学表现与本病临床表现的高相似度提示SHR 可作为良好的ADHD动物模型。SHR 大鼠拥有多动、冲动、注意力不集中的典型ADHD 临床表现（表面效度）；在ADHD 易感基因、脑内神经递质、大脑容量等方面与已被证明的ADHD 理论相符，与ADHD 患儿相似，SHR 大鼠也显示出性别差异，且用于治疗ADHD 的一线药物哌甲酯、托莫西汀对SHR 大鼠有效（结构效度）；SHR 大鼠能够预测临床上尚未阐明的行为、遗传和神经化学等相关因素（预测效度）。SHR 大鼠源自WKY 大鼠，二者有相同的遗传背景，因此WKY 鼠用作SHR 的正常对照［13-14］。但近年来有研究发现WKY 大鼠在行为学实验中活动速度慢，静止时间长，表现出抑郁样特征［15］，作为正常对照的严谨性还值得商榷。因此本研究中设WKY 组、SD 组分别为正常组1、正常组2，SHR 为模型组，探讨WKY、SD、SHR 大鼠DA 合成、清除相关因子表达的差异及药物对上述过程的作用。

单胺类神经递质DA 在前额叶皮质的功能发挥中具有重要意义，其水平异常可见于多种精神神经疾病。DA 代谢的遗传失衡在ADHD 发生中的作用已被包括多巴胺活性药物的有效应用及功能性脑成像等研究所证实，“DA 缺陷理论”是目前ADHD 研究领域几乎公认的ADHD 发生假说，也是国内精神神经疾病的研究热点［16-18］。DA 在脑内生成首先需要TH 催化酪氨酸生成，多巴再被多巴脱羧酶催化，脱去羧基形成DA。TH 在此过程中，是参与反应的起始酶及限速酶，因此TH 在生物体内表达的异常会直接影响到儿茶酚胺类递质的合成［19］。TH 在一些中枢和周围神经元群以及肾上腺髓质嗜铬细胞限制性表达。据人类基因组变异数据库记录显示有41 种疾病由TH 基因点突变引起［20］。DA主要通过再摄取的方式进行清除，所释放的DA 中的75%会通过DAT 再摄取，DAT 是位于多巴胺神经元突触前膜特异性的跨膜蛋白，属于Na＋／Cl－离子依赖型转运蛋白基因家族，可使DA 在突触扩散之前迅速灭活。DAT 与TH、多巴胺D2 受体共定位，表明DAT 是特异性地表达在多巴胺能神经元中。传统观念认为，DAT 的作用是摄取细胞外的DA至细胞内［21］。近年来研究者发现，DAT 重摄取的反应速率与胞外DA 浓度不相匹配，可能的解释是DAT 的构象在向胞内开口的时候，DA 可以通过DAT 释放到胞外［22］。

近年来中医药对ADHD 的研究逐渐深入［23］，心肝火旺证是ADHD 实证最常见的证型［24］，安神定志灵是韩新民教授治疗儿童多动症心肝火旺证的经验方，临床应用30 余年，其对ADHD 心肝火旺证取得了稳定疗效［3］。此方中黄芩清心平肝；醋柴胡、郁金、决明子行气解郁，清肝平肝，并能使热从大肠而下；天竺黄清热豁痰，凉心定惊；炙远志化痰宁心，安神益智；钩藤平肝清热平肝，熄风定惊；石菖蒲豁痰开窍，兼能醒神益智。诸药合用使心火得清，肝阳得平，痰湿得除，神得安志得定，阴阳得平。在本次实验中，增加了SD 大鼠这一正常对照组，使原本饱受争议的SHR 大鼠和WKY 大鼠的对比增加了可靠性。本次实验发现，在DA 合成及清除相关因子TH 和DAT 的表达上，WKY 大鼠与SD 大鼠相比未见明显差异，而SHR 大鼠TH与DAT 蛋白及mRNA 表达与WKY 大鼠及SD 大鼠相比均有显著差异，说明SHR 大鼠与WKY 大鼠这一经典模型-正常对照在此方面基本符合要求。但未进行行为学实验评价大鼠的自主活动及注意力等，ADHD 的模型动物及对照动物选择仍需要更深层次的研究。本次实验发现安神定志灵可能通过升高前额叶TH 蛋白及mRNA 表达及降低DAT 蛋白及mRNA 表达，以促进DA 合成及抑制DA 清除而提高DA水平来达到治疗ADHD 的目的。且发挥作用的剂量组与择思达组比较未见显著差异（P＞0.05）。但安神定志灵低剂量组对TH 表达的调控较优，而安神定志灵中剂量组对DAT 表达的调控较优。提示安神定志灵的疗效发挥未呈剂量依赖，其原因还需进一步探索。免疫荧光结果显示，TH、DAT 阳性细胞在前额叶皮质显著表达，该区域在调控运动、空间时间记忆、注意力等功能上作用突出［8］。除前额叶外，纹状体、海马、杏仁核等区域也与ADHD 的发生相关，下一步需进行更加深入的研究。DA 系统十分复杂，除合成和清除外，其释放机制也十分复杂，涉及DA 突触囊泡循环等过程。这些问题，课题组将在下一步进行探索。