钱苏海，蔡斯琦，丁兴红，丁志山，范永升

（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

蕲蛇为蝰科动物尖吻蝮Agkistrodon acutus的干燥体，其性味甘、咸、温，归肝经［1］，广泛应用于治疗风湿顽痹，如类风湿关节炎、肢体麻木、关节肿胀等。前期研究发现，蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白具有良好的治疗类风湿关节炎作用［2-4］，但其腥味重，化学性质不稳定，药物作用时间短，制约了临床推广应用。

以壳聚糖-海藻酸盐为囊材包埋蛋白是一种新型制药技术，它有助于保持蛋白类药物的生物活性［5-6］，提高胶囊稳定性和载药量，并可调节药物释放速度，实现缓释性能，具有良好的临床应用前景。目前，尚无制备蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白壳聚糖-海藻酸盐纳米胶囊的报道，故本实验通过反相乳化法制备该制剂，正交试验优化其工艺，并对其理化性质进行表征，药物释药性能进行考察，从而为相关新型给药系统的研发提供实验基础。

1 材料

Zetasizer Nano ZS90 激光粒度分析仪、Zeta 电位仪（英国Malvern 公司）；H-7650 透射电子显微镜（日本Hitachi公司）；酶标仪（美国Thermo 公司）；磁力搅拌器（德国IKA 公司）。海藻酸钠、乙酸、氢氧化钠、PBS 缓冲液，氯化钙均为分析纯（上海阿拉丁试剂有限公司）；透析袋（截留分子量10 000）、壳聚糖（生物技术级，脱乙酰度≥95%）（上海麦克林生化科技有限公司）；水为双蒸水（美国Millipore 公司）。蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白［7］（自制，含有量95%）。

2 方法

2.1 纳米胶囊制备 100 mg 海藻酸碾碎，转移到0.5%乙酸中溶解，加入Ⅱ型胶原蛋白冻干粉超声溶解，再加入CaCl2溶液超声乳化完全，缓慢滴加0.5 mol／L NaOH 将pH值调至7.5，得到海藻酸钙Ⅱ型胶原蛋白纳米胶囊，将其洗涤离心后加到壳聚糖溶液中磁力搅拌2 h，即得。

2.2 透射电镜观察 将分散于去离子水的蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白纳米胶囊滴于200 目喷碳铜网上，室温干燥后滴加数微升2% 磷钨酸钠负染液，静置后滤纸吸去负染液，干燥30 min后进行电镜观察。

2.3 粒径、Zeta 电位测定 应用激光纳米粒径仪检测粒径、Zeta 电位，观察粒径分布范围。

2.4 载药量、包封率、释药性能测定

2.4.1 载药量 精密称取纳米胶囊适量（C2）于研钵中研细，适量PBS 缓冲液（0.1 mol／L，pH＝7.2）混匀，待其充分溶胀后再剧烈搅拌30 min，使蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白充分溶出，滤液定容后采用羟脯氨酸法测定羟脯氨酸质量浓度，乘以系数7.46 即为其含有量（C1），计算载药量，公式为载药量＝C1／C2×100%。

2.4.2 包封率 取纳米胶囊约100 mg 于50 mL 量瓶中，PBS 缓冲液（0.1 mol／L，pH＝7.2）定容，待其充分溶胀后离心取上清液，羟脯氨酸法测定上清液蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白质量（C3），沉淀置于研钵中研细，加适量PBS 缓冲液剧烈搅拌30 min，以使蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白充分溶出，羟脯氨酸法测定其质量（C4），计算包封率，公式为包封率＝［C4／（C4＋C3）］×100%。

2.4.3 释药性能 100 mg 海藻酸碾碎，转移到150 mL 0.5%乙酸中，加入100 mg Ⅱ型胶原蛋白超声乳化，得到微乳溶液，将它和纳米胶囊置于含有人工胃液浸液的透析袋内，放入生理盐水中，在不同时间点取样，羟脯氨酸法测定蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白质量浓度，计算药物累积释放率，同时加入等量新鲜人工胃液保持恒定体积。

3 结果

3.1 制备工艺优化 因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平

表2 试验设计与结果

表3 方差分析

由表可知，蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白与海藻酸比例对粒径、Zeta 电位影响最大，壳聚糖溶液浓度次之，CaCl2溶液浓度影响最小；最优工艺 为A3B2C3，即CaCl2溶液浓度20 mmol／L，蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白与海藻酸比例1∶1，壳聚糖溶液浓度1%。再进行3 批验证试验，测定平均粒径为（210±5.12）nm，PDI 为0.16±0.03，Zeta 电位为（－25.46±0.56）mV，粒径分布见图1。

图1 蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白纳米胶囊的粒径分布

3.2 微观形态 图2 显示，纳米胶囊大小均匀，分散性好，表面光滑饱满。

图2 纳米胶囊透射电镜图

3.3 载药量、包封率 纳米胶囊平均包封率、载药量分别为（83.69±4.31）%、（16.35±1.35）%。

3.4 释药性能 图3 显示，纳米胶囊24 h 累积释放率为（81.86±3.15）%，实现了缓释作用；蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白释放的总体趋势是先快后慢，12 h 时微乳释放率不大于55%，而此时纳米胶囊已达到95%。

图3 样品释药性能曲线

4 讨论

本实验通过正交设计［8］获得蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白纳米胶囊最优参数，此时所得制剂性能优良，具有良好的稳定性和粒径分布范围，并且表面光滑饱满，这是因为在形成过程中蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白首先被海藻酸表层富集，之后海藻酸中α-L-古罗糖醛酸单元与CaCl2中钙离子发生交联反应，逐步形成带负电荷海藻酸钙囊壳，它在带正电荷的壳聚糖溶液中受静电作用而进一步成型［9］。进一步研究发现，该制剂具有的良好药物包封性能，这是因为胶囊囊芯中蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白在海藻酸钙与壳聚糖的共同包埋下，由于海藻酸与钙离子交联度反应而使囊膜致密性增加，两者一起形成致密的纳米胶囊网络结构，导致它从基质渗透到外界环境溶液的难度加大，避免了药物泄漏损失，从而具有良好的包封率［10-11］。另外，还测得其平均载药量大于15%，具有一定的临床应用价值。

蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白缓释纳米胶囊具有良好的缓释效果，这可能是由于海藻酸与蕲蛇Ⅱ型胶原蛋白之间受氢键与静电作用，使得其结构更致密，可抑制药物扩散速率［12］，从而实现了该作用。