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(1.上海海洋大学食品学院,国家淡水水产品加工技术研发分中心(上海),上海 201306;2.上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海 201306;3.宁波大学 东海海水养殖协同创新中心,浙江宁波 315211)

脊尾白虾通常被称为小白虾,是中国近海地区重要的经济虾。脊尾白虾对环境具有较强的适应能力,2～35 ℃均能存活,其繁殖能力很强,生长周期短,适合养殖。并且随着养殖技术的发展,也发展出了与其他水产品混养的养殖技术。脊尾白虾富含蛋白质和矿物质,其肉质鲜美,营养丰富[1]。

目前池塘养殖是脊尾白虾的主要养殖方式,通常和三疣梭子蟹和梭鱼等品种混养[2]。目前脊尾白虾池塘养殖过程中,主要依靠投喂冰鲜杂鱼和小麦粉等饵料,但是这些饵料通常存在来源不稳定、营养不平衡、不利于保存、败坏水质等缺点;人工配合饲料具有质量稳定、便于投喂、易保存和污染小等优点,所以,近年来一些养殖区开始研究利用人工配合饲料养殖脊尾白虾[1,3]。

分析样品挥发性成分的仪器主要有电子鼻和GC-MS两种。电子鼻是一种分析仪器,包括气体传感器阵列,信号处理系统和模式识别系统。它可以模仿人类的鼻子闻到被测样品的总体气味,并且可以对样品的气味进行分析、区别、检测[4]。相对于感官评定员对于被测样品气味的评定,电子鼻具有客观性好、重复性高、且不损伤样品的优势,同时,利用电子鼻检测样品方便快捷,操作简单,所以电子鼻被广泛应用于水产品挥发性物质的检测。GC-MS(气相色谱-质谱联用仪,gas chromatography-mass spectrometry)是将样品经过气相色谱将复杂成分分离,再顺序进入质谱检测器进行检测的一套仪器,可以定性和定量分析样品中的挥发性成分。电子鼻可以根据不同的传感器区分不同样品之间的挥发性成分的差异,却不能给样品挥发性成分定性定量。而GC-MS可以相对准确地识别样品中的特定挥发性物质。电子鼻与GC-MS结合使用可以较全面的检测待测样品的挥发性成分,也是目前研究食品中挥发性成分的主要手段[5-6]。Miyasaki[7]等运用GC-MS与电子鼻技术研究了不同种类的鱼肉在冷藏技术下挥发性成分的变化,发现一些可以表征鱼肉新鲜度的醛和酮;施文正等[8]采用GC-MS研究了草鱼肉在不同温度下的挥发性成分。结果表明,草鱼肉中挥发性成分的含量随温度的升高而增加;郑平安等[9]运用HS-SPME结合GC-MS法分析鲐鱼肉经过加热后挥发性成分的变化,发现影响鲐鱼肉挥发性气味的主要物质有己醛、2-己烯醛、2,4-庚二烯醛、2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇等。

近年来,一些养殖区开始使用人工配合饲料喂养养殖脊尾白虾,但人工饲料对于传统饵料的可替代性研究较少,为了研究人工饲料饲喂对脊尾白虾品质的影响,本研究通过顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱法和电子鼻比较两种饲喂方法的脊尾白虾挥发性成分的差异,从而为脊尾白虾养殖和加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脊尾白虾 取自江苏大丰区竹川垦区的海水养殖池塘;NaCl 国药集团化学试剂有限公司;脊尾白虾1#(蛋白含量33.2%,脂肪含量7.3%)和2#饲料(蛋白含量38.7%,脂肪含量8.5%) 均为硬颗粒饲料,饲料粒径分别为1.2 mm和1.6 mm,浙江澳华饲料有限公司;饲料配方 由上海海洋大学甲壳动物营养繁殖实验室提供,饲料配方组成见表1。

固相微萃取(SPME)手动进样手柄 美国Supelco公司生产,65 μm PDMS/DVB(聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯)萃取头;FOX-4000气味指纹分析仪 法国AlphaM.O.S公司;6890 GC-5975 MS联用仪 美国Agilent公司。

表1 脊尾白虾的饲料配方(%)Table 1 Feed formula of Palaemon carinicauda(%)

1.2 实验方法

1.2.1 实验投喂方法 实验的投喂方式为两种:整个过程使用复合饲料喂养,浙江澳华饲料有限公司生产的脊尾白虾1#(蛋白含量33.2%,脂肪含量7.3%)和2#饲料(蛋白含量38.7%,脂肪含量8.5%),其中1#饲料投喂时间为6～8月份,2#饲料投喂时间为9～11月份;全程投喂传统冰鲜饵料,传统饵料由粉碎的冷冻杂鱼和小麦粉组成,两者比例为1∶1。养殖期间根据水温和溶氧情况,每日投喂1～2次,配合饲料的投喂量占虾体重的2%～5%,传统冰鲜饵料的投喂量通常占体重的4%～8%;每日记录各个池塘的投饵和摄食情况,根据实际情况进行水质调控,尽量保证水质良好,氨氮<1 mg/L,亚硝酸盐<0.15 mg/L,pH7.0～9.0。两种饵料各重复3个养殖池塘,池塘面积为2公顷。12月初停止投喂,每个池塘随机取样脊尾白虾1公斤(雄虾体重为(1.76±0.11) g,雌虾体重为(2.13±0.06) g)用于后续分析。

1.2.2 样品前处理 将捕获的两种饲喂模式脊尾白虾,人工分离出雌雄[10](脊尾白虾雄虾在第五对步足之间有雄性凸起,可以方便的进行雌雄辨认)。将取到的虾去头,去壳取肉。GC-MS样品:称取绞碎的虾肉5 g,加入5 mL NaCl溶液(0.18 g/mL),均质后,取适量匀浆液放入15 mL顶空瓶中,加盖并用塑料膜覆盖待测,每组平行测定3次。电子鼻样品:在相同的处理方法后,称取绞碎的虾肉2 g加入2 mL NaCl溶液(0.18 g/mL),均质后,取适量匀浆液放入10 mL进样瓶中。

图1 脊尾白虾雄性附肢(A)及雄性突起(B)Fig.1 Male appendage(A)and male protrusion(B)

1.2.3 电子鼻条件 载气:干燥洁净的空气,流速:150 mL/min;样品温度4 ℃,清洗时间120 s,测样时间600 s;顶空产生参数:产生时间为600 s,搅动速率500 r/min;顶空注射参数:注射体积2500 μL;注射速率2500 μL/s。

1.2.4 GC-MS分析条件 SPME条件:在GC进样口于250 ℃老化30 min后取出萃取头,并将萃取头插入样品瓶中,提取温度为45 ℃(注:萃取头不与瓶中样品接触,调节萃取头位置距离瓶口约4～5 mm),萃取40 min后,取出萃取头并快速将其插入GC进样口中。在250 ℃下解析5 min后,将萃取头取出。

GC条件:HP-5MS弹性毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);不分流模式进样;升温程序参考施文正的方法[11]:柱初温40 ℃,保持2 min,以4 ℃/min升至160 ℃,而后以10 ℃/min升至250 ℃,保持5 min;载气(He)流量1.0 mL/min。

MS条件:传输线温度为280 ℃,离子源温度为230 ℃,四极杆温度为150 ℃;电子能量70 eV;质量扫描范围m/z 35～350。

1.3 数据处理

1.3.1 电子鼻数据分析 电子鼻中自带的Alphasoft V11统计分析软件对样品进行主成分分析(Principal component analysis,PCA)。

1.3.2 GC-MS数据处理 GC-MS数据使用Xcalibur软件处理分析。通过查询NIST和Wily质谱数据库确认定性,并且为了保证被检测组分可靠性,并根据现有文献,当物质正反匹配度均大于800时(最大值1000)才予以确认[11-13]。通过Excel数据处理系统,以面积归一化法确定不同样品中挥发性成分中各化合物成分的相对百分比。

1.3.3 相对气味活度值法评价(ROAV) 人类的鼻子对不同化合物的嗅觉敏感性区别很大,“感觉阈值”定义为某种物质能被人的鼻子感受到的最低浓度[13]。当化合物的浓度恒定时,阈值越低,人们越容易察觉。当化合物的阈值不变时,浓度越高,人们越容易察觉,两者的组合才可以进行有效地客观评价[14]。即“气味活度值(odor activity value,OAV)”其定义为嗅感物质的绝对浓度(C)与其感觉阈值(T)之比,即

其中,采用化合物的相对百分含量代替其绝对含量进行分析,使对样品总体气味贡献最大的化合物:ROAVstan=100,对于其他组分(X)则有

将上式代入,则有:

通过这样的计算,所有组分ROAV值≤100,ROAV值越大则说明该成分对样品的总体气味贡献越大,一般来说,ROAV值≥1的化合物是分析样品中的关键气味化合物,0.1≤ROAV≤1的化合物被认为对样品的总体气味具有重要的修饰性改变作用[14]。

2 结果与分析

2.1 不同饲喂方法脊尾白虾电子鼻分析结果

图2为不同饲喂方法脊尾白虾挥发性气味对传感器响应雷达图,电子鼻测试样品要求待测样品对传感器的最大响应大于0.5,本次实验所有饲喂模式下的脊尾白虾样品均达到了检测要求。从雷达图中可以看到电子鼻传感器对样品的挥发性成分有明显响应,对各样品的响应强度大致相同。

图2 不同饲喂方法脊尾白虾挥发性气味雷达图Fig.2 Radar chart of sensor response of Palaemon carinicauda with different feeding methods

图3是四种脊尾白虾的挥发性成分PCA图,PCA转换并减小传感器响应的特征向量矩阵的维数,并执行线性分类。在失去少量信息的前提下,多个指标转化为一些重要的综合指标。最终结果显示在二维散点图中[15]。图3中,PC1的贡献率为94.832%,PC2的贡献率为4.49%,总贡献率为99.322%,超过了85%,一般认为其总贡献率高于85%即可,并且贡献率越大说明PCA图反映的指标越完整,所以可以认为PCA图较完整的反映样品的原始信息。在PCA图中,其中配合饲料喂养脊尾白虾所在范围较大,但四种脊尾白虾所在区域均有较大重叠,并且四组脊尾白虾均有重叠区域,说明电子鼻并不能区别四种脊尾白虾的气味。电子鼻结果表明配合饲料喂养与传统饵料喂养的脊尾白虾气味相近。

图3 不同饲喂方法脊尾白虾PCA图Fig.3 PCA analysis of volatile flavor compounds of Palaemon carinicauda with different feeding methods

表2 不同脊尾白虾挥发性成分相对含量(%)Table 2 Volatile compounds of Palaemon carinicauda with different feeding methods(%)

2.2 四种脊尾白虾挥发性成分分析

对样品每个色谱峰对应的质谱进行NIST库检索和参考确认,确定不同饲喂方法及性别条件下的脊尾白虾肉挥发性成分,然后采用面积归一化法计算出每一种成分所在样品中的相对含量。如表2所示,在配合饲料喂养脊尾白虾雄虾、雌虾及传统饵料喂养脊尾白虾雄虾、雌虾中鉴定出30、30、29、31种挥发性成分,它主要含有醛和酮、醇类及烃类。

2.2.1 醛类物质 醛类在所有的虾的样品的挥发性成分中有着较大的相对含量占比,且小分子醛类物质的阈值大都较低,因此,醛类物质是脊尾白虾挥发性成分贡献的主要物质。醛类物质阈值低并且有报道醛类物质可以与许多其他气味成分加和形成气味效应[11]。壬醛、己醛、庚醛、辛醛都是饱和的直链醛,饱和的直链醛通常会产生一些令人不愉快的、刺鼻的、辛辣的刺激性气味[17]。并且,取决于碳链的长度,C5～C9醛发出蜡质和脂肪味,C10～C12醛类会发出花香和柑橘香味[18]。戊醛、己醛、庚醛、壬醛、癸醛被认为是淡水鱼特有的泥土腥味的主要成分[12]。段秀霞等[19]发现癸醛、壬醛是凡纳滨对虾虾肉的气味成分主要贡献物质。己醛为大多数鲜鱼的香气贡献了一种独特的粗糙的、绿色植物般的醛香气味[20]。四种脊尾白虾中检测到的醛是己醛、庚醛、壬醛、癸醛、十二醛。肉豆蔻醛只在配合饲料喂养脊尾白虾样品中检测到,传统饵料喂养脊尾白虾雄虾和雌虾均未检测出该物质。其中壬醛在所有挥发性成分的相对含量最大,在一定浓度时,壬醛会散发出清香味,浓度过高则会表现出明显的动物油脂味[21]。且壬醛在所有检测出的物质中其阈值最低,仅为1 μg/kg,因此壬醛对脊尾白虾的气味贡献最大。

2.2.2 酮类物质 酮类物质一般是由多不饱和脂肪酸的受热氧化或是氨基酸分解产生的[22],并且它们的阈值通常高于醛的阈值。酮类物质一般表现为花香和果香,其香气特征随着碳链的增加而增强[18]。此外,据报道,酮类对腥味物质的味道有增强的作用,可以增强或改变腥味物质[23]。脊尾白虾中的酮类物质主要有苯乙酮与甲基庚烯酮,且酮类物质的种类与相对含量都较少。有文献报道,甲基庚烯酮也在蟹类动物中存在。脊尾白虾中所检测出的酮类物质不多,在所有的脊尾白虾样品中都检测出了苯乙酮、2-莰酮、甲基庚烯酮。

续表

注:ND:表示未检出;-:未查到其阈值的相关文献报道;同行上标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.2.3 醇类物质 醇类物质主要来源于糖、氨基酸和醛类物质的还原[24],也有可能是多不饱和脂肪酸受热氧化和降解的产物[25]。醇类物质大多会产生一些柔和的味道。醇类物质一般阈值较高。四种脊尾白虾样品中都检测出了1-辛烯-3-醇、1-壬醇、柏木醇、桉树醇。所有检测到的醇中,桉树醇的相对含量最高。其中1-辛烯-3-醇是一种低阈值醇,其阈值只有1 μg/kg,它拥有着类似蘑菇的香味所以也被称为蘑菇醇。不仅在虾肉中,1-辛烯-3-醇也在一些其他水产品如鱼类和蟹类的挥发性成分中被检测到[26],可以说它是一种广泛存在于水产品中的挥发性化合物,在四种脊尾白虾中,它的相对含量不多,只有0.6%左右。

2.2.4 其他物质 除了醛酮醇类物质,四种脊尾白虾中也检测出来对气味有贡献的物质如萘、1-甲基萘、2-甲基萘、D-柠檬烯和含硫化合物苯并噻唑等物质。萘是一种含苯环的物质,它们会散发出一种令人难以接受的刺激性气味,对脊尾白虾的气味影响来说,它们的存在是一种负面作用,对于它们的存在,较普遍的解释是它们来自水产品所处的环境的污染。D-柠檬烯是烯烃类物质,能散发出一种类似柑橘的气味。苯并噻唑是一种含硫化合物,它们的阈值较低。在一些海虾的虾肉中或其他水产品如牡蛎等,会检测出一些其他的含硫化合物如二甲基硫醚和二甲基三硫醚[14,27-28]。同时,二甲基硫醚也是烹调牡蛎香气中公认的香气化合物[19],虽然它们在水产品中的相对含量很低,但是它们的阈值很低,例如二甲基三硫醚的阈值仅为0.005 μg/kg,所以其对虾肉的气味影响较大,有的文献也以此物质为对气味贡献最大的物质并将此物质定位相对气味活度值最高的组分,而在脊尾白虾虾肉中并未检测到该物质,其原因可能是虾体所处的生长环境不同,或者用于提取挥发性组分的萃取头之间的差异。

2.3 气味贡献评价

在四种脊尾白虾中,壬醛的气味活度值最高,因此壬醛的相对气味活度值(ROAV)定义为100,以此计算其他气味物质的ROAV。

从表3中可以看出,对脊尾白虾气味成分起决定贡献作用的物质是:壬醛、癸醛、1-甲基萘、1-辛烯-3-醇、2-甲基萘、十二醛、桉树醇、D-柠檬烯、庚醛、己醛。对脊尾白虾气味起修饰作用的有:萘、苯并噻唑、甲基庚烯酮、壬醇、苯乙酮等。

表3 不同脊尾白虾挥发性气味成分的 相对气味活度值(ROAV)Table 3 Relative odor activity values of volatile components from Palaemon carinicauda with different feeding methods(ROAV)

结合表2,四种脊尾白虾主要气味成分和气味贡献相似。对脊尾白虾气味成分起决定贡献的物质主要是醛类和醇类物质,醛类物质中,壬醛、癸醛、十二醛对气味贡献相对最高,庚醛、己醛的气味贡献相比于其他物质会少一些,但是醛类物质有气味叠加效应,所以可以认定醛类物质是四种脊尾白虾气味构成的主要物质。而除了醛类物质,醇类物质如1-辛烯-3-醇、桉树醇也对四种脊尾白虾气味起到了相对较高的贡献,在一些文献中,蘑菇醇与一些醛类物质如壬醛、癸醛等也被认为是水产品鱼虾蟹的特征气味[12,14,29-31]。桉树醇是类似樟脑气息的物质,在醇类物质中,它的相对含量最高,且它的阈值低,所以其对样品的气味贡献相对较大。D-柠檬烯会散发出一种类柑橘味的甜香,虽然它的相对含量不高,然而,它的阈值较低,因此它对脊尾白虾的整体气味也有较大贡献。而除了以上物质,所有的脊尾白虾中也检测出了含苯环的1-甲基萘、2-甲基萘这两种物质,这两种物质会产生一些刺激性气味,对虾肉的整体气味起到负面作用,并且这两种物质的相对含量较高其阈值也低,所以在脊尾白虾气味贡献中他们甚至会高于一些醇类和醛类物质[14]。

此部分物质对脊尾白虾气味的构成起到修饰作用,这些物质对气味的贡献比ROAV大于1的物质小。四种脊尾白虾中,都检测出了有壬醇、甲基庚烯酮、萘、苯并噻唑,其中苯并噻唑是一种含硫化合物,它会产生一阵类似肉香和坚果香。在配合饲料喂养的脊尾白虾虾肉中均检测出了肉豆蔻醛,传统饵料喂养脊尾白虾则未检测到该物质,肉豆蔻醛(即十四醛)会散发出类似脂肪和牛奶的香味,但其在配合饲料喂养脊尾白虾中的含量很少,所以其对脊尾白虾总体气味影响不大。而剩余的物质如苯乙酮、2-莰酮等因为这些物质的相对含量较少或是阈值较大,导致它们的相对气味活度值低于0.1,这类物质对总体气味的形成影响并不大,所以不做考虑。

3 结论

本研究对两种饲喂方法的脊尾白虾挥发性成分进行了分析,利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)在配合饲料喂养脊尾白虾雌虾与雄虾和传统饵料喂养脊尾白虾雌虾与雄虾中共检测出了30、30、29、31种挥发性成分。醛类6种,酮类4种,醇类5种。结合ROAV得出脊尾白虾关键气味的物质是:壬醛、癸醛、1-甲基萘、1-辛烯-3-醇、2-甲基萘、十二醛、桉树醇、D-柠檬烯、庚醛、己醛。且四种脊尾白虾关键气味基本相似,这与电子鼻分析结果一致,电子鼻并不能较好的区分四种脊尾白虾总体气味。研究结果说明两种饲喂方法的脊尾白虾挥发性气味成分非常接近,配合饲料喂养模式可以代替传统饵料喂养模式。