杨国荣，封林奇，顾锦涛，贾博，穆楠

(1.空军军医大学基础医学院学员一大队，西安 710032； 2.空军军医大学肿瘤生物学国家重点实验室药学院生物制药学教研室，西安 710032； 3.空军军医大学第一附属医院神经外科，西安 710032；4.空军军医大学基础医学院生理与病理生理学教研室，西安 710032)

脑胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的颅内原发恶性肿瘤，包括星形胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤和混合性胶质瘤4种类型，而在星形胶质细胞瘤中级别最高的胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常见的成人颅内恶性肿瘤，世界卫生组织分级达到Ⅳ级[1]。GBM呈浸润性生长，常侵犯周围正常组织，手术完全切除非常困难，复发率高[2]。目前，临床对于GBM的治疗普遍采用最大安全范围手术切除、替莫唑胺(temozolomide，TMZ)化疗及辅助性放疗相结合的方案，但患者的中位生存期仍无明显延长[3]，且GBM患者相较于其他类型的胶质瘤患者更易对TMZ产生耐药[4-5]。因此，如何减少GBM患者的TMZ耐药作用，提高GBM患者的化疗敏感性，降低患者肿瘤的复发率，是GBM临床治疗急待解决的问题。现有的研究显示，DNA损伤修复、细胞自噬和胶质瘤干细胞(glioma stem cells，GSCs)等途径广泛参与GBM发生、发展的肿瘤生物学进程，并直接介导了TMZ耐药产生[6-7]。现就GBM TMZ耐药机制的研究进展予以综述。

1 DNA损伤修复与TMZ耐药

TMZ属于烷化剂，口服生物利用度近乎100%，且易透过血脑屏障，为目前治疗GBM的一线化疗药物。TMZ进入肿瘤细胞后其分解产物可导致DNA的甲基化，进而干扰细胞的DNA复制，造成DNA损伤，达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。但是在GBM细胞中存在极强的DNA损伤修复系统和复杂的损伤修复机制，这些修复机制是介导GBM对TMZ产生耐药的重要原因。目前认为，TMZ耐药是 O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methyl-guanine-DNA-methytransferase，MGMT)、错配修复(mismatch repair，MMR)、碱基切除修复(base excision repair，BER)等DNA损伤修复系统以及自噬、肿瘤干细胞等共同作用的结果[8]。而在GBM的DNA损伤修复方面，新近的研究主要集中于MGMT、MMR以及一些具有调控DNA损伤修复功能的基因方面。

1.1MGMT介导的GMB耐药 MGMT的主要作用是在TMZ造成肿瘤细胞DNA损伤之前逆转TMZ对DNA的甲基化作用，它可以直接从鸟嘌呤O6的位置上去除烷基基团，导致TMZ治疗失效，而GMB细胞中MGMT表达相对稳定且较其他类型胶质瘤高[9]。因此，阐明调控MGMT的关键分子和信号通路，成为TMZ耐药领域的研究热点。

1.1.1MGMT阳性GBM与TMZ耐药 MGMT启动子甲基化与MGMT基因的表达密切相关，MGMT启动子甲基化后可直接抑制MGMT基因的转录。Tezcan等[10]发现，欧油菜叶提取物通过促进MGMT启动子甲基化，协同增加了GBM的TMZ反应，提高了TMZ敏感性；此外，欧油菜叶提取物还可能通过下调p53抑制GBM细胞，从而将TMZ的作用机制从典型的诱导细胞凋亡转变为激活线粒体死亡通路或坏死。

此外，Yang等[11]发现，沉默特异AT序列结合蛋白1基因也可以引起MGMT表达的下调和SLC22A18表达的上调，从而缓解GBM的TMZ耐药，提示特异AT序列结合蛋白1基因对MGMT介导的TMZ耐药具有重要意义。然而，MGMT启动子甲基化有时与MGMT表达水平并不一致，提示可能有新的基因表达调控机制存在。如Chen等[12]报道了一个名为“K-M增强子”的增强子，它是一个具有调节MGMT表达功能的远端增强子，K-M增强子的激活可以“绕过”MGMT启动子甲基化，激活MGMT的转录。这一发现有助于解释部分GMB细胞中MGMT启动子甲基化与其表达水平不一致的情况，还可以解释部分MGMT启动子甲基化较高的GMB患者预后仍较差的问题。因此，MGMT基因的表达调控不仅仅依赖于启动子甲基化修饰这一表观遗传学水平，一些基于MGMT基因的转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平的调控机制研究将有助于更好地回答MGMT基因对TMZ治疗的影响。

1.1.2MGMT阴性GBM与TMZ耐药 具有MGMT表达的GBM患者对TMZ治疗具有先天的耐药性，但MGMT基因缺陷的GBM患者也不一定对TMZ敏感。Yi等[13]研究发现，经过持续的TMZ治疗后，大多数最初对TMZ敏感的MGMT阴性GBM患者也会产生TMZ耐药；进一步研究发现，脱氢胆甾醇2(dehydrocholesterol 2，DHC2)的表达是MGMT缺陷细胞获得TMZ耐药性的关键调控分子，而且在复发性MGMT缺陷的TMZ抵抗性GBM患者的肿瘤组织中DHC2表达显著增强。其机制主要是持续的TMZ治疗诱导了GBM的细胞骨架重排，继而诱发DHC2的表达；抑制DHC2的表达可以增强TMZ诱导的DNA损伤，提高MGMT阴性的GBM细胞对TMZ的敏感性，但该调控通路在MGMT阳性患者的GBM细胞中并不显著[14]。此外，脱氢表雄酮可通过降低MGMT阴性GBM细胞的DNA损伤阻止TMZ诱发的细胞凋亡，其主要机制是脱氢表雄酮激活LYN-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)级联反应，促进Sp1(specificity protein 1)磷酸化，磷酸化的Sp1定位于TMZ损伤的DNA，进而阻止了进一步的DNA损伤，同时磷酸化的Sp1还能募集组蛋白去乙酰化酶来完成去乙酰化，去乙酰化的Sp1可以招募增殖细胞核抗原来减弱DNA损伤，降低TMZ的毒性[15]。

1.2MMR介导的TMZ耐药 MMR作为DNA修复机制的一种，发生在DNA损伤后。MMR可以拮抗TMZ对GBM细胞的损伤作用，修复发生损伤的DNA，导致GBM对TMZ的敏感性降低。新近的研究发现，在进行DNA损伤修复的过程中存在不成功的MMR，这种不成功的MMR发挥与MMR截然相反的作用[16]。在TMZ的甲基化靶点中，DNA的鸟嘌呤O6是极为关键的一个，鸟嘌呤的甲基化可以引起碱基错配，而在DNA复制时不成功的MMR可将新合成链中错配的胸腺嘧啶(O6-甲基鸟嘌呤-胸腺嘧啶)识别并切除，从而导致DNA双链缺口形成，随着DNA复制的进行DNA损伤不断积累，引起细胞周期停滞，启动细胞的凋亡，以此来增加TMZ的敏感性；而MMR的功能缺失会导致错配修复无法进行，若O6-甲基鸟嘌呤-胸腺嘧啶的错配一直存在，则会引起更多的碱基错配，最终导致基因突变，GBM的进展加快，使得肿瘤细胞对TMZ产生耐药[17]。因此，无论是不成功的MMR还是MMR缺陷都使得GBM对TMZ治疗产生耐药。研究发现，对于MMR缺陷所致的TMZ耐药的GBM，通过提高极样激酶1(polo-like kinase 1，PLK1)的表达可以抑制其生长[18]。另外，Stritzelberger等[16]发现，洛莫司汀也可克服由MMR缺陷所引起的TMZ耐药，另外，当过量的O6-甲基鸟嘌呤导致MGMT饱和时，错配的碱基也会触发这种重复但不成功的MMR，进而诱导凋亡。而相较于MMR，BER是修复DNA碱基损伤的主要DNA修复途径，有研究发现，激活的C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白8-松弛素/胰岛素样肽受体1-信号转导及转录激活因子3通路可以促进GBM细胞的BER，并导致对TMZ的耐药[19]。

1.3调控DNA修复的基因 TMZ引起的DNA甲基化并不能直接触发GBM细胞的死亡，它需要在甲基化后通过DNA复制和MMR来积累DNA损伤，最终导致DNA双链断裂的形成，而在此过程中X线修复交叉互补基因3(X-ray repair cross complementing gene 3，XRCC3)起关键调控作用。在生理情况下，XRCC3对于维持基因组完整性和细胞的存活至关重要，而在高级别的胶质瘤中XRCC3表达水平升高，过表达的XRCC3可通过同源重组促进双链断裂的修复，继而保护GBM细胞免受TMZ诱导的细胞死亡、凋亡和细胞周期抑制，直接参与TMZ耐药的形成；XRCC3剔除后，TMZ引起的双链断裂修复概率显著降低，GBM对TMZ的敏感性大幅提升[20]。此外，α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征(α-thalassemia mental retardation syndrome X-linked,ATRX)基因也可通过调节DNA的损伤修复来参与GBM的TMZ耐药，ATRX基因剔除可抑制DNA的复制和损伤修复，进而抑制GBM的生长和侵袭，增加TMZ治疗的敏感性[21]。因此，ATRX基因的表达也是胶质瘤患者预后更好、生存时间更长的标志。ATRX基因发挥作用的具体机制是：ATRX表达的抑制导致36位赖氨酸位点的三甲基化修饰的组蛋白H3(H3K36me3)降低，而H3KPme3是毛细血管扩张性共济失调突变(ataxia telangiectasia mutated，ATM)信号通路的重要参与者，H3KPme3的减少降低了ATM的乙酰化，导致TMZ诱导的ATM信号通路的激活受到抑制，而ATM信号通路又是重要的DNA修复机制，其抑制使DNA修复减少，TMZ对细胞的杀伤效果增强；反之，ATRX基因表达的升高可以增强ATM信号通路的激活，导致TMZ耐药的发生[21]。此外，有研究发现，生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45A(growth arrest and DNA damage inducible protein 45A，GADD45A)作为一种应激蛋白，在TMZ作用于GBM时通过促进DNA的修复保护了GBM细胞，导致TMZ耐药的形成；细胞暴露于基因毒性环境中时，GADD45A被激活，导致G2/M细胞周期检查点的执行，从而为DNA修复提供时间，活化的GADD45A通过与增殖细胞核抗原和脱嘌呤嘧啶核酸内切酶相互作用促进DNA的损伤修复，导致TMZ耐药的发生，其具体机制可能与p53通路有关[22]。

2 肿瘤细胞自噬与TMZ耐药

2.1细胞自噬概述 细胞自噬是降解受损或退化的细胞器或受损蛋白质的一种亚细胞过程，是细胞应对不良外界环境的应激反应[23]。细胞自身可以利用降解所产生的物质来维持细胞内能量代谢的平衡，其次这种溶酶体介导的反应也可以将受损细胞降解以维持其他正常细胞的存活[24]。目前大量研究证实，自噬可能是肿瘤细胞面对治疗压力时的促生存反应，自噬可通过促进肿瘤细胞的密集增殖帮助肿瘤细胞抵御多种不利的环境因素(如化疗药物、放射线等)，从而使肿瘤细胞在某些治疗中存活[25]。但是过度的自噬则会导致细胞死亡，称为自噬性细胞死亡或Ⅱ型程序性细胞死亡[23]，因而抑制细胞自噬可以降低这种形式的细胞死亡。

2.2自噬与TMZ耐药 关于自噬在GBM的TMZ耐药中发挥的作用目前仍不明确，对于自噬与TMZ耐药的关系也一直存在很大争议。少部分的报道认为，诱导自噬可以提高TMZ的细胞毒性，而抑制自噬则会降低疗效；但大部分部分观点认为，抑制自噬可以增加TMZ化疗的敏感性，如白藜芦醇在TMZ治疗GBM中所发挥的协同效应是通过抑制自噬而产生的[23]。在Vu等[24]的研究利用CRISPR/Cas9将GBM的肿瘤细胞产生自噬小体所必需的自噬相关蛋白5基因剔除，结果发现，这种剔除只对自噬产生抑制作用，并未改变肿瘤细胞对TMZ的敏感性，同时也未发现TMZ可以诱导自噬。而有研究指出，TMZ可以通过诱导自噬性死亡杀伤GBM肿瘤细胞[23]，Vu等[24]推测这种结果可能是肿瘤细胞变异所导致的。

另有研究表明，抑制GBM肿瘤细胞线粒体自噬后可以提高TMZ敏感性，增强TMZ的细胞毒性[26]。Lohitesh等[27]发现，TMZ诱导的自噬使GBM细胞中保护性ATP大量增加，这种变化有利于肿瘤细胞抵抗TMZ的毒性作用，而促进耐药的形成。这也从侧面说明抑制GBM自噬的发生可以抑制耐药的形成。Filippi-Chiela等[28]的研究发现TMZ对GBM细胞造成的急性DNA损伤激活了AMP活化的蛋白激酶催化亚基/AMP活化的蛋白激酶-unc-51样激酶1和促分裂原活化的蛋白激酶14通路，并持续下调Akt-磷脂酰肌醇-3-激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路，导致自噬的活化；自噬与衰老标志物的表达呈显著负相关，在DNA损伤前通过抑制mTOR可以促进细胞衰老，在损伤后可以通过抑制自噬进而诱导细胞凋亡，提高TMZ的敏感性，更多地杀伤肿瘤细胞。此外，有研究发现，某些药物可以通过抑制自噬而对TMZ产生特异性增敏作用，如Thioridazine，它抑制自噬后可以抑制与TMZ耐药相关代谢通路的改变，而使GBM对TMZ的作用更敏感[29]。综上，虽然自噬在GBM的TMZ耐药过程中发挥了重要作用，但具体机制仍需要进一步的研究，为解决GBM的TMZ耐药性难题提供新的视角。

3 GSCs与TMZ耐药

3.1GSCs概况 GSCs是胶质瘤组织中存在的极少具有“干细胞特征”的细胞亚群，具有自我更新、不断增殖等特性[30]。1992年，Reynolds等[31]首次提出，包括人在内的哺乳动物的胶质瘤中存在GSCs，随后被众多研究者证实。有学者报道，因胶质瘤病理类型和级别的不同，GSCs所占比例为0.3%～9.1%[32]。Kondo等[33]报道，C6胶质瘤细胞系中GSCs约占0.4%。还有研究发现，多形性GBM中GSCs所占的比例为0.5%～3%，而髓母细胞瘤中这一比例为0.5%～0.8%[34]。以上研究表明，GSCs的比例与肿瘤的病理类型和恶性程度密切相关，且各类型中GSCs所占比例存在较大的差异。目前认为，GSCs样细胞是GBM的起源细胞之一，是GBM极为容易复发的重要原因，也是GBM对放化疗产生耐受的主要根源，在GBM发生和发展过程中起重要作用。

3.2GSCs与TMZ耐药 对于GSCs与GBM耐药性的关系，学界普遍认为，GSCs的存在使GBM细胞对TMZ等药物治疗产生了耐药性，从而导致治疗效果不佳，但其中的机制还有待进一步阐明[35]。Auffinger等[30]认为，在经过TMZ等化疗药物的治疗后，胶质瘤内部分肿瘤细胞会转化为GSCs，而这一类细胞会体现出对化疗药物更强的耐药性，影响治疗效果。而Gong等[36]的研究发现，TMZ虽然可以导致神经干细胞死亡，但是对GSCs的作用较小，而这种作用与多重耐药的ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白G2基因的表达相关；另外，在对ABC转运蛋白超家族的研究中发现，这一类蛋白可以帮助肿瘤细胞将TMZ泵出细胞，从而产生耐药性。ABC转运蛋白家族成员中的ABCB1、ABCC1和ABCG2在CD133+细胞亚群中明显高表达，提示其可能是GSCs耐药性产生的一个重要机制[37]。Yu等[38]的研究联合使用二甲双胍和TMZ处理GSCs后发现，GSCs自我更新能力降低，同时对TMZ的敏感性增加，而Akt-mTOR通路活性的下调则部分解释了其中的机制。体内研究发现，GSCs容易向肿瘤周边的脑组织迁移和侵袭，手术并不能将这些侵入肿瘤周边的GSCs全部清除，即使术后辅助放、化疗等，最终仍难以将其全部杀灭，GSCs因此成为胶质瘤术后复发的“种子”细胞[39]。除上述因素外，前文提到的MGMT同样在GSCs的TMZ耐药性形成中发挥重要作用。研究发现，MGMT在CD133+细胞中高表达，而MGMT启动子甲基化状态在未分化和参与分化的GSCs中对TMZ的敏感性表现出很大的差异，说明MGMT可能通过某种机制参与了GSCs耐药性的产生[40]。此外，HH(Hedgehog)/Gli1信号通路也参与这一过程，GSCs异常激活了HH/Gli1信号通路，环巴胺对该信号通路抑制后可以显著降低MGMT的表达[41]，表明在GSCs水平上确实存在HH/Gli1信号通路的调控机制，该信号通路可以调控GSCs中MGMT的表达和TMZ耐药，这为解决GSCs的TMZ耐药和GBM高复发率提供了一个新的研究方向。

4 小 结

GBM是脑胶质瘤中恶性程度最高、最具侵袭性的一种，且极易复发，长期存活率极低，目前只能以手术切除，再辅以放化疗。而GBM对一线化疗药物TMZ易产生耐药，除了一部分先天对TMZ不敏感的肿瘤细胞，一些原本敏感的肿瘤细胞也会在化疗过程中逐渐发生获得性耐药，这极大地影响术后化疗的效果。在获得性耐药形成的过程中DNA损伤修复、细胞自噬、肿瘤干细胞等都发挥重要的作用。目前的研究虽然揭示了GBM治疗过程中TMZ耐药形成的许多调控过程，但还有更多的问题尚未解决。近年来单细胞组学、高通量蛋白质组学、代谢组学等多重组学研究的发展，将为TMZ耐药机制的系统阐明提供极为有利的帮助。