张庆伟，温智婷，罗克明

（西南大学 a.生命科学学院；b.三峡库区资源与环境教育部重点实验室； c.重庆市资源植物保护与种质创新重点实验室，重庆 400715）

油桐Vernicia fordii为大戟科油桐属落叶乔木，原产我国，种植范围比较广，在我国已有上千年的栽培历史[1]。油桐种子富含油脂，称为桐油，是植物油中最优质的干性油，具有干燥快、附着力强、比重轻、富光泽、耐酸、耐碱、耐高温、抗冻裂、防水、防腐、绝缘、抗辐射、抗渗透等优良特性，被广泛用作兵器、车船、电子、电器、建筑、装饰、机械、渔具等的环保型涂料[1-2]。随着人们环境意识和健康意识的增强，环保型油漆已成为油漆产业发展的重要趋势；而桐油作为制造环保型油漆最适宜的原料，其需求量正日益增长；与之相对应，油桐产业的发展将极大地带动我国贫困地区的经济发展，对于精准扶贫具有重要的战略意义[2]。此外，桐油与柴油有着相似的物质结构，是制造生物柴油的一种优质原料。油桐作为生物质能源树种有望成为缓解我国能源短缺问题的重要生物质能源树种之一[3]。因此，油桐产业发展的受重视程度日益增长，油桐的生物学研究也逐渐增多，并已取得了很多重要的进展。本文将总结油桐的组学研究、光合生理、油脂形成机理和组培快繁等方面的研究进展，讨论目前研究中存在的问题，并对未来发展方向进行展望。

1 花的发育与性别决定

油桐为雌雄同株异花植物，较低的雌雄花比例是其产量较低的主要原因，探究其花性别决定的机制，对于培育高雌花比例的油桐品种至关重要。Mao 等[4]利用形态学与比较转录组方法研究了油桐性别决定的分子机制，他们发现油桐花发育可以分为12 个时期，在第7 个时期，雌花和雄花开始出现形态上的分化。雄花一直是单性的，而雌花则具有两性特征，其雄蕊仅发育至造孢母细胞时期，之后便发生细胞死亡。雌花和雄花比较转录组结果表明，雌花的二态性受到茉莉酸、一些重要的转录因子以及与花分生组织活性相关基因的影响。后续的蛋白质组研究[5]鉴定出2 个雄花中特异表达的蛋白和10 个雌花中特异表达的蛋白，后者包括抗坏血酸过氧化物酶、天冬氨酸蛋白酶、亲环蛋白等，都与雄蕊的败育和雌蕊群的形成有关系，作者认为他们可作为潜在的油桐花性别分化的分子标记。Liu 等[6]通过形态学和细胞学观察、内源激素测定和RNA-seq 等方法探讨了油桐雌花发育的分子机制。形态学观察表明，雌花雄蕊的凋谢属于细胞程序化死亡（PCD），是在小孢子母细胞时期绒毡层退化的结果。通过RNA-seq 鉴定出279 个差异化表达基因，这些基因与苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代谢、类黄酮合成、淀粉和蔗糖代谢以及植物激素信号转导相关。基因表达分析证实17 个与花粉和花药发育相关基因以及37 个PCD 相关基因都参与到这个过程中。对植物激素水平进行分析表明水杨酸的积累触发了PCD，并且抑制了雌花雄蕊的发育。

2 光合作用和矿质营养

光合作用是油桐种子油脂合成的基础，决定了油桐的产量和品质。石凯等[7]分析了4 种光照条件（100%、75%、50%和20%光强度）对油桐幼苗生长的影响，发现光照强度的降低将导致油桐的净光合速率、气孔导度、最大光化学效率、表现光合电子传递速率及蒸腾速率的降低。不同农林作物的间作同样会对光合作用产生影响，油桐幼林套种大豆的研究[8]表明，套种大豆降低了油桐幼苗的光饱和点、光补偿点和CO2补偿点，说明套种大豆虽然降低了油桐幼苗的光合能力，但有利于提高油桐幼苗对弱光的利用能力，且有助于光合产物的积累。

矿质营养水平对植物的光合作用具有直接的影响，补充矿质营养对于油桐生长发育具有重要作用。李泽等[9]利用营养液砂培试验发现低镁浓度（Mg2+＜2 mmol·L-1）显著抑制了油桐的生长，叶绿素含量、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活性、净光合速率、水分利用效率、最大光化学效率等参数显著降低。这些指标会随着镁离子浓度的增高而增高；当镁离子浓度为2 ～4 mmol·L-1时，最有利于油桐幼苗正常生长。与此类似，刘凯 等[10]也发现低镁浓度显著降低了2 种油桐叶片最大净光合速率等光合参数，增加了游离脯氨酸的含量。此外，根外追肥能够提高油桐幼苗的光合能力，从而增加了生物量的积累，如叶片喷施尿素和KH2PO4能够显著提高油桐幼苗叶片的净光合速率等光合参数，叶面喷施尿素的作用比KH2PO4的作用更明显[11]。在基因研究层面，Zhou 等[12]克隆得到了1 个油桐中编码磷酸盐转运蛋白的基因（Pht1;1），并进行了结构预测与表达模式分析，发现该基因在成熟叶柄中表达量最高，种子中也有较高表达；故推测Pht1;1可能具有多种磷元素摄取和转运功能。

3 生物与非生物胁迫

与常见农作物相比，我国经济林往往种植在环境恶劣、缺少管理的地区，因此经济林时常面临干旱低温等问题。探究油桐对于干旱等逆境胁迫的反应，对于培育具有更强适应性的油桐品种具有重要意义。张帆航等[13]选取1年生油桐幼苗为试验材料，研究了低温（8 ℃）和高温（38 ℃）对油桐幼苗生长及生理特性的影响。结果表明低温和高温均可导致油桐幼苗生长减缓，叶绿素含量下降，抗氧化酶（如过氧化物酶）活性升高，以及可溶性糖和丙二醛含量上升。叶片喷施油菜素内酯可以减轻温度胁迫对油桐叶片的抑制程度，增强油桐叶片的生理功能，如提高叶片内各种抗氧化酶活性，降低丙二醛含量等，进而增加油桐幼苗的抗热性和抗寒性。此外，长期低温不仅显著降低油桐树幼苗的光合效率，还影响植物叶片内部结构的形成，破坏了叶绿体的完整性和功能；而将油菜素内酯外用在油桐树幼苗上，可以通过维持叶片结构、形态、功能的稳定，减轻冻害造成的伤害，从而提高桐树的光合潜力[14]。干旱也是对油桐生长产生影响的因素之一，Li 等[15]研究发现干旱处理12 d（土壤含水量由27.3%降至9.5%）导致油桐幼苗相对叶绿素含量降低，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性降低，光合速率和光系统II 的光化学效率降低；外源施用CaCl2能够提高油桐幼苗的干旱耐受性，其中5 mmol·L-1比2 mmol·L-1和10 mmol·L-1的CaCl2更为有效。不同的水分供应量同样会对油桐的生长产生影响[16]：轻度干旱胁迫（70%土壤最大持水量）对三年桐和千年桐幼苗的生长无明显影响；中度干旱（50%土壤最大持水量）及重度干旱（35%土壤最大持水量）使2 种油桐的生长量、净光合速率和最大光化学效率等指标显著下降。不同之处在于：中度干旱胁迫下，油桐幼苗净光合速率的降低是由气孔因素及光合机构活性降低共同引起的；而重度干旱胁迫下，净光合速率降低主要是由光合机构活性降低引起的。该研究还发现三年桐的光合机构活性及光合效率高于千年桐，对干旱胁迫的适应性要强过千年桐[16]。在基因研究上，刘美兰等[17]克隆了油桐乙醛脱氢酶基因ALDH2B4和ALDH2B7，发 现ALDH2B4在 嫩叶的表达量最高，而ALDH2B7在花瓣的表达量最高，2 个基因表达都受高盐、干旱和脱落酸调控，它们可能在油桐逆境胁迫应答和脱落酸信号途径中发挥作用。

过量农药的使用同样会造成胁迫，万盼等[18-19]分析了2 种农药百草枯和氰戊·乐果对油桐幼苗叶绿素荧光特性及生长的影响。结果表明：高浓度百草枯（≥1/200）和氰戊·乐果（≥1/500）能够显著降低油桐幼苗叶绿素含量和光合速率，表现为油桐幼苗的光系统Ⅱ最大光化学效率、光化学猝灭系数和电子传递速率均显著低于对照，从而抑制油桐幼苗株高、地径和单株生物量的生长，降低油桐幼苗根冠比，进而导致根系吸收面积减少，影响幼苗后期的生长。在商品规定施用浓度下，百草枯（1/400）和氰戊·乐果（1/1 000）的施用对油桐幼苗光合速率和生长影响均较小。

油桐容易受到尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.Fordiis，Fof-1）的毁灭性伤害，木油桐Vernicia montana则具有较强的抗性。Zhang 等[20]在Fof-1侵染油桐根部过程中的不同阶段进行了对比转录组分析，分别在油桐和木油桐中发现了434 和192个差异性表达的转录因子；通过共表达分析发现含有B3 结构域的转录因子（VmB3-01），可能在油桐对Fof-1 的抗性中发挥着重要作用。

4 油桐基因组研究

Li 等[21]报道了油桐叶绿体基因组，其序列长度为161 528 bp，含有1 对反向重复序列（IRs），被1 个小的单拷贝（SSC）和1 个大的单拷贝（LSC）所分割开，包含114 个基因，编码81 个蛋白质、4 个rRNA 和29 个tRNA。与麻风树叶绿体基因相比，油桐叶绿体基因组具有85 个单核苷酸多态性位点和82 个插入或缺失突变。Cui 等[22]对油桐进行了高质量基因组测序，产生了176 Gb 基因组序列数据，组装后的基因组大小为1 176 320 kb（scaffold N50 ＞474 kb），预测其包含47 000 个蛋白编码基因。基因组和转录组分析显示，油桐基因组包含与脂肪酸去饱和化和共轭化、酰基编辑以及甘油三酯的合成相关的基因。种子转录组分析揭示了脂肪酸合成基因特殊的表达模式，即脂肪酸β-氧化和甘油三酯合成在种子发育的中期协同发生，这2 个途径在时间上的精确控制可能对于α-桐酸的积累至关重要。这些结果对于通过遗传改良以提升油桐种子油脂含量具有重要作用。此外，Zhang 等[23]还报道了另外1 个染色体尺度的油桐基因组，其大小为1.12 Gb，包含28 422 个预测基因和超过73%的重复序列。同时基于基因组和RNA-seq 的数据，鉴定出了88 个核酸结合位点编码抗性基因（nucleotide-binding site-encoding resistance genes），其中17 个基因有助于油桐在感染萎病菌后短期内抗性的发挥。在该基因组中一共有651 个油脂相关基因被鉴定出来，其中88 个基因可能直接参与桐油的合成。另外该研究发现，油桐基因组中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因数量较少，并且一些转录因子与油脂合成的基因之间存在协同效应，这些都可能是种子种油脂含量较高的重要原因。值得注意的是，Zhang 等[23]还在油桐基因组测序的基础上采用了不同生长阶段的17个组织样本建立了油桐全基因表达的eFP browser （http://bar.utoronto.ca/efp_tung_tree/cgi-bin/efpWeb.cgi），这项工作为油桐基因功能的深入研究提供了重要基础。

5 分子标记与遗传多样性分析

分子标记对于现代植物育种具有重要的作用，而油桐为多年生乔木，其基因组庞大，一般采用转录组测序、种间扩增、全基因组关联性分析等方法开发其分子标记。Zhang 等[24]对来自中国5个省的41 份油桐种子进行脂类分析，并通过转录组测序鉴定出818 058 个非重复序列基因，发现其中5 404 个具有SSR 标记位点，对其中98 个位点进行分析，开发了15 个多态基因SSR 标记，这些标记相关基因中的10 个基因能够编码功能蛋白，而且部分基因与种子油脂含量高度相关。该研究有助于了解油桐的遗传多样性和进行遗传作图。Zhang 等[25]曾在油桐基因组测序未完成之前，利用木薯基因组序列开发适用于油桐的SSR 标记，结果发现在木薯的225 个SSR 标记种的104 个适用于油桐。此外，ISSR 标记被用于分析2 个地理种群（恩施与遂宁）之间的遗传变异和分化，结果表明这2 个地区的油桐种质存在中等程度的遗传多样性，原因可能是空间上的隔离和历史上长期的地方性繁育[26]。吴攀[27]对含油率不同的油桐树的种子进行转录组测序分析，鉴定到分布于 15 340 个注释基因上的70 315 个SNP 位点，并对含有SNP 位点的基因进行GO 分类和KEGG 富集分析，发现1 096 个SNP 位点匹配到与油脂合成相关的GO 分类的基因上，1 231 个SNP 位点位于脂肪酸合成相关KEGG 通路中，这些SNP 位点有望进一步开发为功能分子标记。除此之外，对于筛选到的21 个可能影响油桐种子含油率和脂肪酸组分的候选SNP 位点，通过候选基因位点与油桐种子含油率等表型性状之间的关联分析获得5 个显著关联的位点，其中3 个分别在VfPDAT2、VfLPAAT1和VfPDH-α3的5’-UTR 区域，说明这些SNP 变异位点很可能在调控水平影响油脂积累[27]。

6 油脂合成的分子机制

桐油中含有80%左右的桐酸，桐酸是具有3 个共轭双键特异脂肪酸，其化学性质活泼，是优质、多用途的工业原料。长期以来，油桐中油脂合成途径一直是关注的焦点，从20 世纪90年代至今，研究人员开展了大量的桐油合成机理研究，其中Shockey 等[28]鉴定出2 个甘油二脂酰基转 移 酶（diacylglycerol acyltransferases，DGAT）DGAT1和DGAT2，通过酵母异源表达证明这2 个基因参与桐油的合成。此外，Dyer 等[29]发现2 个油酸去饱和酶FAD2 和FADX 在发育的种子中特异性地表达，酵母异源表达试验结果表明，FAD2能够将油酸转化为亚油酸，而FADX 能够将亚油酸转化为桐酸。这些重要的研究都为揭示桐油合成机理奠定了重要的基础。近年来，越来越多的组学研究技术也被应用到对于油桐油脂合成机制的研究当中，通过对油桐基因组的分析，Zhang 等[23]发现了几个重要的参与油脂合成的新基因，其中包括2 个FAD3基因，其负责Δ15 亚油酸的去饱和，在种子发育的早期高度表达；除此之外，进化树研究表明，FAD2和FADX基因被分在2 个分化枝上，这可能来源于双子叶植物祖先的基因组加倍事件。Galli 等[30]通过对成熟油桐种子进行转录组测序，重点关注脂质代谢途径基因的表达，结果发现，基因BCCP，FAD2，FAD3，FADX，FAD9，DGAT2和OleoI在种子发育后期高度表达，与油脂积累正向相关。同样通过比较转录组方法，Zhang 等[31]采用RNA-seq 技术对高含油率油桐树和低含油率油桐树不同发育时期的种子进行转录组测序分析，结果表明，高含油率的原因在于与糖酵解、脂肪酸合成以及三酰甘油酯组装相关基因在油料积累的后期仍高度表达；基因PII、LEC1和LEC1-LIKE应该对于高含油率的产生具有重要作用。除了转录组分析，蛋白质组分析也被用于研究油桐油脂合成过程，Zhan 等[32]发现油桐种子油脂的积累胚乳细胞内油体的体积和数量正相关，并开展了蛋白质组分析，鉴定出了76 个蛋白，这些蛋白多数与能量代谢、脂肪酸代谢以及对抗病菌有关。此外，Chen 等[33]鉴定并比较了油桐和大戟科其他物种的tRNAs，86 个差异表达的tRNAderived RNA 片段（tRFs）被鉴定出来与脂类合成有关，其中11 个已被研究证明受到17 个tRFs 的调控。这些都有助于认识油脂合成的遗传机制。

除去组学研究之外，对油桐特定基因的研究工作也取得了一定的进展。油桐油脂积累在油体中被低分子亲水的油体蛋白（OLE）所包裹，Cao等[34]对22 个树种（如桐树、茶树、蓖麻等）的OLE 进行分类并开展全基因组分析，鉴定保守序列基序和氨基酸残基、预测OLE 的二维和三维结构。李捷宇等[35]克隆了油桐长链脂酰辅酶A 合成酶基因（Long-chain acyl coenzyme A synthetase，LACS）家族的2 个成员LACS4和LACS8基因，并检测了不同组织部位和种子不同发育时期各基因的表达水平，其中LACS8基因在发育种子中的表达模式与之相一致，推测该基因可能与种子发育过程中的油脂积累相关。Long 等[36]克隆了β-酮脂酰-ACP 合成酶基因（β-ketoacyl-acp synthase gene，KAS），并进行了表达模式与组织特异性分析；结果显示油桐树中有不同的时空表达模式，与成熟组织相比，KAS-Ⅱ在幼嫩组织中的表达水平明显降低，而在幼茎和幼叶中，KAS-Ⅲ的表达水平最高。刘美兰等[37]克隆了FATB1基因，并对该基因的表达模式和表达部位进行了研究分析，结果显示FATB1是1 个位于叶绿体中且含有多个催化功能结构的蛋白，表达模式与油脂积累相同，因此它可能与油脂合成有着密切的关系。杨丹等[38]研究了桐酸合成酶基因FADX在油桐种子发育过程中的表达特征，结果显示FADX在油桐果实发育早期处于低表达状态，从果实发育中期开始大量表达，这与油桐桐酸含量在果实发育过程中的变化规律一致。Yang 等[39]克隆到7 个油桐NF-YB家族转录因子基因，发现NF-YB1、5和11主要在种仁中表达，推测其有可能参与到种子发育或脂肪酸合成。

7 组织培养

目前油桐繁殖方法是通过有性生殖获得种子、再播种育苗，实生后代植株参差不齐，植株间产量品质差异极大，从而显著影响到油桐品种产量潜力的发挥与桐油品质的稳定性。优异基因型的优良性状不能通过有性繁殖稳定地传递给后代，克服此问题的有效途径就是无性繁殖。植物组织培养作为一种高效的无性繁殖方式，相关技术在油桐中同样得到重视。早在2009年，张姗姗等[40]就通过无菌苗茎段诱导产生不定芽，进而生根的方式建立了油桐的组培快繁体系。之后，李泽等[41]以“葡萄桐”种胚为试材建立了油桐种胚成苗的组培体系。谭晓风等[42]以油桐无菌苗叶片为外植体，筛选获得了愈伤组织诱导、不定芽分化、增殖及后续生根的最适宜培养基。近年来，林青等[43]以油桐无菌苗叶柄为外植体直接诱导不定芽实现植株再生；而穆燕等[44]以油桐无菌苗下胚轴为外植体，通过直接器官发生（诱导不定芽）途径建立了简单的、可重复的油桐离体再生体系。谷战英等[45]以油桐成熟叶片和组培苗幼叶为材料，通过酶解法成功分离得到油桐叶肉细胞的原生质体，并以获得的原生质体为受体系统，建立了PEG 介导的油桐原生质体基因转化方法，对于通过细胞融合和基因工程手段进行油桐种质创新具有重要的意义。

8 总结与展望

油桐在我国有上千年的栽培历史，我国的桐油生产曾经在世界上具有重要影响力。面对新的发展机遇（环保型材料和生物质能源的开发等），重新挖掘和利用油桐资源，发挥其在材料工业、国防工业、生物质能源等领域的重要作用，推进油桐产业的快速和规模化发展，是当前油桐相关科技工作者的重大而艰巨的任务[1]。近5年来油桐相关的生物学研究得到了全面的开展，并取得了一系列的重要成果，主要包括油桐基因组测序的完成、油桐花发育和性别决定的研究、相关植物组织培养技术的建立以及油桐特殊油脂产物——桐油合成的关键基因发掘等。但目前的研究仍然存在一些尚未解决的重要问题，具体如下：

1）虽然油桐基因组测序已完成，但对于其深入挖掘和利用的工作有待进一步进行。例如开展比较基因组学的研究和开展基于桐油合成的全基因组关联研究等。

2）目前一批与油桐响应环境变化、参与特殊油脂合成的基因已被初步发掘，但对于这些基因功能的认识都缺乏有力的遗传学证据。其主要原因在于缺少相应的转基因和基因编辑研究，因此未来应该注重转基因及基因编辑相关的研究。

3）目前我国油桐林多数处于山区地带，时常面临干旱、营养缺乏和光照不足等逆境，开展油桐响应与适应逆境以及养分吸收利用等方面的研究是进行油桐品种改良的重要前提。而目前多数研究所采用的材料为温室环境下的盆栽幼苗，这并不能完全反映成年树木在真实生产环境中的情况，更不能反映实地环境对于桐油产量和品质的影响。因此应该加强实地成年油桐的研究，以更好地为生产和育种提供理论基础。

4）目前油桐林栽植中的种苗来源主要是种子播种，但油桐实生后代植株参差不齐，植株间产量品质差异极大，油桐品种产量与桐油品质都受到显著影响。在目前油桐组培快繁技术较为成熟的情况下，应加速油桐的组培快繁技术的推广应用，以解决油桐单株产量和桐油品质不稳定的问题。