孙金秋 徐莞媛 马杭柯 高 威 欧阳乐飞 高 焕,2,3,4 阎斌伦,2,3,4

脊尾白虾丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及其表达特征分析*

孙金秋1徐莞媛1马杭柯1高 威1欧阳乐飞1高 焕1,2,3,4阎斌伦1,2,3,4①

(1. 江苏省海洋大学 江苏省海洋生物资源与生态环境重点实验室 江苏省海洋生物技术重点实验室 连云港 222005；2. 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心 连云港 222005；3. 江苏省农业种质资源保护与利用平台 南京 210014；4. 江苏省海洋资源开发研究院(连云港) 连云港 222005)

本研究根据脊尾白虾()转录组序列，采用cDNA末端快速扩增技术克隆获得了脊尾白虾丝氨酸羟甲基转移酶基因()。该基因cDNA全长为1855 bp，其中，开放阅读框为1407 bp，5¢端非编码区为39 bp，3¢端非编码区为409 bp，共编码468个氨基酸，预测蛋白质的分子质量为152.55 kDa，理论等电点为4.90。同源性分析显示，脊尾白虾基因与甲壳类动物真宽水蚤(s)同源性最高，为96%。荧光定量分析结果显示，基因在脊尾白虾眼柄、胃、肝胰腺、心脏、鳃、肠、肌肉、腹索神经、皮下脂肪以及卵巢中均有表达，其中，卵巢表达量最高，心脏次之。不同浓度Cd2+胁迫结果显示，其在低浓度(0.0100、0.0175和0.021 mmol/L) Cd2+胁迫中的表达模式基本一致，呈先升高后下降再升高再下降的趋势；而在高浓度(0.0278 mmol/L) Cd2+胁迫中，该基因表达量很低，甚至不表达，说明高浓度Cd2+胁迫可以抑制该基因的表达，具体机制有待进一步研究。

脊尾白虾；丝氨酸羟甲基转移酶基因；基因克隆；组织表达；Cd2+胁迫

丝氨酸羟甲基转移酶(Serine hydroxyl methyl- transferase, SHMT)是一类广泛存在于原核生物和真核生物中含有磷酸吡哆醛(PLP)四聚体的蛋白质(Schirch, 2005)，其主要功能是在亚甲基四氢叶酸存在时，催化甘氨酸–丝氨酸相互转化为许多生物合成反应提供一碳单元，一碳单位代谢是所有生物尤其是植物体内重要的初级代谢反应，将氨基酸代谢与核苷酸及一些重要物质的生物合成关联起来(Bauwe, 2003)，线粒体为单碳供体如丝氨酸、甘氨酸、肌氨酸和二甲基甘氨酸提供氧化的场所(Tibbetts, 2010)。目前，关于SHMT的研究在微生物、植物和动物中均有报道(McClung, 2000; Garrow, 1993; Bauwe, 2003; 林颖辉等, 2018)。仅在拟南芥()中就发现基因的7种亚型：1、2、3、56和7，其中，1和2被认为可能为线粒体型，3为胞质型，但胞浆型(4和5)和细胞核(6和7)中的定位仍有待证实(Wei, 2013; McClung, 2000)。

关于SHMT酶活性质和性能等方面的研究多集中在微生物领域(冯炎, 2002; 孔庆胜等, 2010)。在细胞生理学上，SHMT是叶酸代谢过程中的关键酶之一，参与DNA、RNA合成、甲基供体及甲硫氨酸和辅酶等多种终端产物的合成。SHMT也能够催化5,10-亚甲基四氢叶酸水解生成5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸的合成过程被认为是一碳单元和还原性叶酸在细胞中短暂保存的形式。基因在植物中的研究多与生长、抗逆和抗病虫害有关(Weinstock, 1970; 朱晓岚, 2017; 孙洁等, 2016; Sonnewald, 2008)。除此在外，还可通过影响机体的异常甲基化而引起致癌基因的激活和抑癌基因的失活，促进肿瘤的发生，因此，其在人类中的研究多与肿瘤有关(王益民等, 2006)。已有研究证实，在癌细胞增殖过程中，线粒体型2的表达显著升高，胞质型1的表达没有明显变化(Deberardinis, 2011; Koppenol, 2011)。但该基因在甲壳生物中还未见报道，其生物学功能尚不清楚。在前期获得的不同饥饿胁迫条件下的脊尾白虾转录组序列中发现了该基因，本研究旨在通过克隆该基因并进一步阐释其在脊尾白虾中的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用脊尾白虾取自实验室同一个母本繁育而来的家系成体，选取正常条件下体格健壮、大小均匀的脊尾白虾3只，分别取其眼柄、胃、肝胰腺、心脏、鳃、肠、肌肉、腹索神经、皮下脂肪以及卵巢10个组织用于RNA的提取。

1.2 Cd2+胁迫条件的设置

根据预实验结果，采用单因子实验设计的方法，设置对照组和4个不同浓度梯度的实验组：实验组1 (0.0100 mmol/L)、实验组2 (0.0175 mmol/L)、实验组3 (0.0210 mmol/L)和实验组4 (0.0278 mmol/L)，各梯度以1 mol/L的CdCl2原液进行调配。胁迫实验在室内独立养殖箱(长×高×宽为80 cm×60 cm×60 cm)中进行，实验前在该环境(室温20~25℃，盐度25)下暂养7 d，期间每天换水1次，早晚投喂饵料及吸污各1次。实验时，每组选择大小均匀、健壮的脊尾白虾70尾，期间为避免水环境中Cd2+浓度变化幅度较大，采取不投饵、不换水的方式。胁迫实验共进行96 h，分别在0、3、6、12、24、48、72和96 h共8个时间点取样，每组每次共取3个平行样品。

1.3 总RNA的提取和cDNA合成

1.3.1 总RNA的提取 用滤纸吸干脊尾白虾表面的海水后，分别选取脊尾白虾各组织样品用于RNA的提取。RNA提取采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒[生工生物工程(上海)]，为防止RNA污染以及降解，提取过程需全程佩戴口罩，勤换手套，并采用RNase Free的实验器材。1%琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性，微量分光光度计UV-Vis测定RNA纯度，RNA于–80℃保存。

1.3.2 cDNA第一链的合成 以脊尾白虾各组织混合RNA为模板，一部分直接反转录为cDNA，合成试剂盒选用PrimerScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)。另一部分利用SMARTTMRACE cDNA amplification 试剂盒(TaKaR)，分别合成5¢和3¢RACE-ready cDNA，余下RNA于–80℃保存。

1.4 引物及其序列

实验所用引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，序列见表1。

1.5 脊尾白虾SHMT基因的克隆

1.5.1 脊尾白虾基因cDNA核心片段的克隆 以脊尾白虾转录组序列为模板，设计核心序列引物(表1)。以脊尾白虾各组织混合cDNA为模板，PCR扩增核心片段，克隆产物通过1.5%琼脂糖凝胶验证。切胶纯化回收目的产物，胶回收试剂盒选自生工生物工程(上海)有限公司。回收纯化后产物经克隆转化后送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

1.5.2 脊尾白虾基因cDNA 5¢和3¢末端的快速扩增 根据获得的脊尾白虾基因的核心片段，设计特异性引物IS-DNMT-GSP-1-1用于5¢端的快速扩增，IS-DNMT-GSP2-1、IS-DNMT-GSP-2-2和IS-DNMT-GSP2-5用于3¢端的快速扩增(表1)。25ml反应体系，PCR反应程序按照TaKaRa RACE扩增试剂盒中的要求进行。反应完成后，1.5%琼脂糖凝胶电泳验证，切取目的条带并回收，克隆测序，方法同上。测序结果在DNAMAN v6软件完成拼接，拼接序列在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对，获得完整的cDNA序列。

表1 实验所用引物

Tab.1 Primers used in the experiment

1.5.3 脊尾白虾基因DNA全序列的克隆

根据已获得的脊尾白虾基因cDNA序列设计覆盖全序列的5对内含子验证引物，分别以脊尾白虾cDNA、DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物以1%凝胶电泳验证不同DNA模板中同一引物扩增产物条带大小是否一致，以此来判定DNA序列中是否存在内含子。

1.6 脊尾白虾SHMT基因的生物信息学分析

基因的生物信息学分析主要通过以下程序或软件进行：利用NCBI对所获得基因序列进行检测和氨基酸序列比对；利用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/gorf.html)软件进行基因的开放阅读框预测以及其所编码氨基酸序列的分析；利用在线软件ExPASy Prot Param (http://web.expasy.org/ protparam/)进行蛋白质理化性质分析；利用Compute pI/Mw软件(http://web.expasy.org/compute_pi/)进行理论等电点和分子量的计算；利用SMART软件(http://smart.embl- heidelberg.de/index2.cgi)进行信号肽预测及蛋白结构域的预测分析；通过在线软件Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)对基因进行亚细胞定位；用MEGA6.0软件进行氨基酸序列的多重比对及NJ系统进化树的构建。

1.7 脊尾白虾SHMT基因组织表达水平分析

根据已获得的脊尾白虾基因cDNA全序列设计荧光定量引物，并以脊尾白虾18S rRNA作为内参基因(表1)进行组织表达分析(薛蓓等, 2017)。

qRT-PCR分析所用试剂选自SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒(TaKaRa)，每个反应设3个平行样，反应体系20ml：2×SYBR Premix ExTMⅡ 10 µl，dd H2O 4 µl，cDNA模板4 µl，Rox Reference DyeⅠ(50×) 0.4 µl，正反向引物(10 µmol/L)各0.8 µl，反应程序按照试剂盒要求进行，qRT-PCR扩增在Step One Plus仪器上进行。

1.8 数据分析

实验最终各定量结果采用SPSS 18.0和Excel软件进行统计分析，并采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和最小显著差异法(LSD)比较不同数据组间的差异，<0.05表示差异显著，<0.01表示极显著差异。

2 结果

2.1 脊尾白虾SHMT基因序列全长及分析

脊尾白虾cDNA全长为1855 bp (GenBank登录号：MH013225)，开放阅读框为1407 bp，5¢非编码区为39 bp，3¢非编码区为409 bp，共编码468个氨基酸，预测蛋白质的分子质量为152.55 kDa，理论等电点为4.90。7对内含子验证引物在脊尾白虾cDNA和DNA中的扩增结果一致，表明该基因不含内含子。应用SignalIP软件对SHMT预测蛋白信号肽分析，显示该蛋白不含信号肽序列。亚细胞定位软件Cell-PLoc 2.0预测脊尾白虾定位于线粒体中。

2.2 脊尾白虾SHMT基因同源性分析

为了解脊尾白虾基因与其他物种的同源性关系，从NCBI的GenBank数据库中选取15条不同物种的SHMT氨基酸序列，使用MEGA 6.0软件(Neighbor-Joining法)对脊尾白虾SHMT进行聚类分析，构建进化树。如图2所示，脊尾白虾与甲壳类动物真宽水蚤()聚为一类，且同源性较高，之后与昆虫类聚为一类。脊椎动物中智人()和猩猩()聚为一类，随后与小鼠(s)、牛()和斑马鱼()聚为一类。最后，牛的2和植物类、原生动物单独聚为一类。该聚类结果符合传统分类学结果。

2.3 脊尾白虾SHMT的组织表达特征分析

为了解在脊尾白虾不同组织间的表达特征，利用荧光定量PCR技术对脊尾白虾10个组织中mRNA水平进行检测。结果显示(图3)，在10个组织中均有表达，但不同组织间差异显著，其中，在卵巢中表达量最高，显著高于其他各组织(<0.01)，心脏次之。

图1 脊尾白虾SHMT基因的DNA全长序列及其编码的氨基酸序列

加粗部位为起始密码(ATG)和终止密码(TGA)，方框内为甘氨酸富集区域(GLQGGP)，下划线部位为加尾信号(AATAA)

The bold sections were the start codon (ATG) and the stop codon (TGA), the letters in box indicated conserved glycine rich region, and the underlined sections were the tailing signal (AATAA)

图2 脊尾白虾SHMT系统进化树分析

图3 脊尾白虾SHMT在不同组织中的表达特征

E: 眼柄; S: 胃; HE: 肝胰腺; H: 心脏; G: 鳃; I: 肠; M: 肌肉; V: 腹索神经; SAT: 皮下脂肪组织; O: 性腺不同字母表示不同组织的表达量差异显著(<0.05)

E: Eyestalk; S: Stomach; HE: Hepatopancreas; H: Heart; G: Gill; I: Intestines; M: Muscle; V: Ventricular nerve; SAT: Subcutaneous fat tissue; O: Ovarybar of each column with different small letters mean significant difference (<0.05)

2.4 不同浓度Cd2+胁迫下脊尾白虾SHMT的表达特征

不同浓度的Cd2+胁迫下，脊尾白虾的qRT-PCR结果见图4。脊尾白虾含量在对照组中显示出相对平稳的趋势，实验组1 (0.0100 mmol/L)和实验组2 (0.0175 mmol/L)均表现出自3 h开始升高后下降再升高的趋势，不同的是，实验组1 (0.0100 mmol/L)经下降后，相对于对照组，在96 h极显著升高(<0.01)，实验组2 (0.0175 mmol/L)经下降后在24 h表现出相对于对照组极显著升高(<0.01)；实验组3 (0.0210 mmol/L)在6 h开始有相对于对照组的极显著升高(<0.01)，随后下降再升高；实验组4 (0.0278 mmol/L)表现出相对于对照组的极显著降低(<0.01)，几乎不表达。

图4 不同浓度Cd2+胁迫下脊尾白虾体内SHMT基因的表达量随时间的变化

*表示与对照组相比差异显著(<0.05)，**表示与对照组相比差异极显著(<0.01)

*and ** represent significant difference (<0.05) and highly significant difference (<0.01) between test and control, respectively

3 讨论

通过将丝氨酸和四氢叶酸转化为甘氨酸和N5,N10亚甲基四氢叶酸，为核苷酸、蛋白质和甲基的生物合成过程提供活化的一碳单元。研究表明，丝氨酸羟甲基转移酶中均含有一个保守的甘氨酸富集区域GLQGGP，可能在与5'-磷酸吡哆醛结合过程中发挥重要作用，说明是以磷酸吡哆醛为辅酶进行反应的(Usha, 1994)。进化树分析发现，其与甲壳动物真宽水蚤胞质型聚为一类，而亚细胞定位软件预测脊尾白虾定位于线粒体，因此，还需要进一步的研究进行验证。

在研究脊尾白虾组织表达特异性中发现，其在卵巢中表达量极显著高于其他各组织，该表达模式与在斑马鱼中的表达模式相似，同时，支持了可能是母系必需基因的观点(Chang, 2007; Vatcher, 1998)。除此之外，有研究发现，在家蚕()的脂肪体和表皮中表达量最高，可能在丝素合成过程中有重要作用(李俊龙, 2014)。据此，推测脊尾白虾卵巢中的高表达可能也与其发育有关。

重金属镉(Cd)是目前近海主要污染物之一，在水体中不易降解，水生物通过食物链的富集可达到数千乃至万倍，且不易排出体外(张瑞等, 2013; 冼健安等, 2012; van Hattum, 1989)。脊尾白虾养殖和繁育近海海域区域受到重金属镉污染的问题越来越受到关注(李先超, 2011)。研究表明，镉可对甲壳动物产生的不利影响是多方面的，主要表现在体内主要抗氧化酶活、代谢酶活、细胞结构的损伤以及抑制卵巢发育(Wu, 2004; Zhang, 2014; 李文艳等, 2008)。除此之外，还会影响多种生物出现异常甲基化以及某些功能基因的表达(王子成等, 2009; 王丙莲等, 2006; Zhang, 2015)，因此，希望通过脊尾白虾体内在应对Cd2+胁迫的表达特征，来分析其可能具备的生物学功能。本研究发现，在低浓度实验组(实验组1、实验组2和实验组3)中均表现出波动状态；但在高浓度实验组(实验组4)，其表达量明显下降，这说明长时间低浓度Cd2+的胁迫可能导致机体的适应，这与李文艳等(2008)的研究结果一致。但高浓度的Cd2+胁迫可能对机体损伤较大，使其代谢机制出现异常，直接表现为氨氮排泄量增加，耗氧量(O/N)降低(Zhang, 2014)，的表达相应受到抑制。其内在的作用机制还有待进一步研究。

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Cloning and Expression Analysis of Serine Hydroxyl Methyltransferase () Genes from

SUN Jinqiu1, XU Wanyuan1, MA Hangke1, GAO Wei1, OUYANG Lefei1, GAO Huan1,2,3,4, YAN Binlun1,2,3,4①

(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Bioresources and Environment, Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005; 2. Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-Industry Technology, Lianyungang 222005; 3. Jiangsu Provincial Infrastructure for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm, Nanjing 210014; 4. Marine Resource Development institute of Jiangsu (Lianyungang), Lianyungang 222005)

In this study, based on the transcriptome ofunder hunger stress,genes were obtained by rapid amplification of cDNA ends (RACE) (GenBank accession No: MH013225). The full-length cDNA of thegene was 1855 nucleotides and contained an open reading frame (ORF) of 1407 bp, encoding a protein of 468 amino acid residues, with the predicted molecular weight of 152.55 kDa, and theoretical isoelectric point of 4.90. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis indicated thatgene is most homologous (96%) with that of. The expression pattern ofgene in different tissues was analyzed by qRT-PCR. The results showed thatgene was expressed in all tissues of. Transcript levels were high in the heart and ovary and were significantly higher in the ovary than in the other tissues. The results of different concentrations of Cd2+stress showed that the expression patterns of lower cadmium stress were basically the same, showing a trend of alternately first increasing and then decreasing. Under high concentration of Cd2+stress, the expression level was extremely low; and not even detected in these tissues. This suggests that high concentration of Cd2+stress can inhibit the expression of thegene. The specific mechanism needs further study.

; Serine hydroxyl methyltransferase; Gene cloning; Tissue expression; Cd2+stress

S917.4

A

2095-9869(2020)01-0127-08

10.19663/j.issn2095-9869.20181229001

* 江苏省高等学校自然科学研究重大项目(17KJA240001)、江苏省“六大人才高峰”创新人才团队项目(2016- HYGC-CXTD-004)和淮海工学院研究生创新项目(XKYCXX2017-21)共同资助 [This work was supported by Natural Science Foundation of Jiangsu Higher Education Institutions of China (17KJA240001), “Six Talent Summit” Innovative Talent Team of Jiangsu (2016-HYGC-CXTD-004), and Huaihai Institute of Technology Graduate Innovation Project (XKYCXX2017-21)]. 孙金秋, E-mail: 1171840685@qq.com

阎斌伦，教授，E-mail: yanbinlun1962@163.com

2018-12-29,

2019-01-22

http://www.yykxjz.cn/

孙金秋, 徐莞媛, 马杭柯, 高威, 欧阳乐飞, 高焕, 阎斌伦. 脊尾白虾丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及其表达特征分析. 渔业科学进展, 2020, 41(1): 127–134

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YAN Binlun, E-mail:yanbinlun1962@163.com

(编辑 冯小花)