张启财，孙中磊，张 赛

(1.滦州市人民医院，河北 滦州 063700；2天津市神经创伤修复重点实验室暨武警特色医学中心，天津 300162；3 枣矿集团中心医院 ，山东 枣庄 277100)

越来越多的研究表明颅脑创伤(TBI)是认知功能障碍的外在危险因素之一，其机制主要包括淀粉样蛋白沉积、脱髓鞘、神经炎症等[1]。创伤后认知功能障碍通常是由于髓鞘膜的破坏和轴突丢失所致，尽管急性炎症可以通过多种免疫调节剂和免疫抑制剂进行治疗，但目前尚无轴突修复和再生髓鞘的治疗方法[2]。众所周知，保护轴突完整性对于预防神经功能障碍是必要的[3]，当发生了轴突断裂或损伤通常会导致永久性神经功能缺损[4]。因此，迫切需要认识和发展具有使轴突髓鞘再生的能力的分子。最新的研究表明组蛋白乙酰基转移酶抑制剂会诱导胶质细胞IL-33表达，促进髓鞘再生[5]。IL-33属于警报蛋白分子家族，被公认为是保护宿主免受入侵者的第一反应者，IL-33在自身免疫和炎性疾病状态下的具有免疫调节功能[6]。虽然IL-33治疗能够改善认知功能障碍[7]，但过表达IL-33能否促进髓鞘再生仍未可知。为此本研究开展了过表达IL-33对TBI小鼠髓鞘再生和认知功能的研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要材料 SPF级雄性C57小鼠32只，6月龄，体重28.0±2.0g，由人民解放军军事医学科学院动物实验中心提供(SCXK-(军)2012-0004)，并且所有实验均获得武警后勤学院附属医院动物伦理委员会的批准。IL-33过表达腺病毒表达载体AAVrh.10IL-33与腺病毒衣壳AAVrh.10Null购自济南思科生物科技有限公司；髓磷脂碱性蛋白(MBP)和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)和β-actin抗体购自美国abcam公司；Trizol及去RNA酶处理的物品购自美国sigma公司；RT-PCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成， BCA 蛋白试剂盒购自碧云天科技公司。

1.2 TBI小鼠模型制备 小鼠经2%的异氟烷麻醉，备皮，沿矢状切开头皮，剥离骨膜，以囟点为原点于双侧外后方2.5 mm处行颅骨钻孔(直径约3.0 mm)，显露硬脑膜，并保持其完整无损。除sham组外，各组小鼠采用皮质撞击致伤法构建TBI模型，将eCCI打击壁调整至与垂直方向呈20°角，使用2.5 mm打击帽精确打击右侧大脑皮层以造成TBI，打击速度5 m/s，停留时间200 ms，造成弥漫性脑损伤。充分止血后，各组分别进行脑室注射治疗。

1.3 动物分组 32只小鼠按随机数字表法等分为4组：sham组8只、TBI组8只、NC组8只和IL-33组8只。其中sham组仅开骨窗暴露硬脑膜不做打击处理，其余3组通过皮质打击法构建TBI动物模型。IL-33组TBI术后立即脑室表达IL-33基因的腺病毒的载体，NC组脑室注射等量的不含IL-33基因的腺病毒，sham组与TBI组注射等量人工脑脊液。

1.4 慢病的载体治疗 NC组与IL-33组分别注射等量AAVrh.10Null和AAVrh.10IL-33，sham组与TBI组脑室注射等体积人工脑脊液。以前囟为坐标原点，向小鼠双侧海马内注射，坐标如下：向外1.7 mm，向后1.2 mm，硬脑膜下方1.7 mm。将微量注射针头缓慢进入目标结构，停留1 min，分别向双侧海马区分别注射载体2 μL(速度0.5 μL/min)，注射后，针头停留2 min以减少回流，然后缓慢撤回。注射后，缝合皮肤，观察小鼠麻醉恢复及神经系统并发症。实验开始28 d后，将小鼠安乐死，灌注后取脑，左侧大脑半球用于RT-PCR和Western印迹分析，右侧大脑半球用于LFB染色。

1.5 RT-PCR检测IL-33 mRNA表达 使用Trizol提取细胞内RNA，利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA链。利用荧光定量PCR试剂盒检测细胞内IL-33 mNRA的表达，β-actin作为IL-33的内参[8]。

1.6 Western blot印迹分析 取小鼠大脑制成蛋白匀浆，使用BCA蛋白质测定试剂盒测量每个样品的总蛋白量。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，半干转至PVDF膜。将膜在4℃下用含10%脱脂奶粉的TBST缓冲盐水封闭1 h，然后在含一抗的10%脱脂奶粉的TBST缓冲液过夜：兔抗MBP抗体(1∶1 000)、兔抗MOG抗体(1∶1 000)、兔抗β-actin抗体(1∶1 000)。TBST冲洗4次，然后将膜与山羊抗兔二抗(1∶10 000)孵育2 h，TBST冲洗后采用ECL试剂盒检测条带的化学发光，使用ImageJ软件分析图像。

1.7 Morris水迷宫实验 实验第24～28天，通过Morris水迷宫实验观察TBI小鼠学习记忆功能的恢复情况。直径120 cm高50 cm的水迷宫，放满水，控制水温25℃左右。在第一象限水面下1 cm深设置平台。将小鼠分别从水池4个象限放入水池中，开始计时，观察记录小鼠从不同象限放入后找到平台的时间，即逃避潜伏期时间。实验结果选择TBI组和NC组作为对照组，选择效果最佳的治疗组作为水迷宫实验统计的数据。

1.8 LFB染色 4%多聚甲醛固定脑组织48 h，石蜡包埋、固定、切片(片厚5 μm)，脱蜡后进行劳克坚牢蓝(LFB)染色[9]，显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 IL-33过表达模型评估 IL-33组小鼠脑组织IL-33mRNA及蛋白的相对表达量较NC组均明显增加，差异均具有统计学意义(H=17.886，P=0.007；H=18.446，P=0.014)，且TBI组、NC组与sham组之间差异均没有统计学意义(P>0.05，见图1)。

**：与NC组比较，P<0.01。图1 各组小鼠IL-33mRNA和蛋白表达水平

2.2 IL-33过表达促进髓鞘蛋白增加 TBI组小鼠脑组织MBP和MOG蛋白的相对表达量较sham组均明显减少，差异均具有统计学意义(H=24.136，P=0.001；H= 24.401，P=0.000)，IL-33组小鼠脑组织MBP和MOG蛋白的相对表达量较NC组均明显增加，差异均具有统计学意义(P=0.042，P=0.036)，而TBI组与NC组之间差异没有统计学意义(P>0.05，见图2)。

**：与sham组比较，P<0.01；##：与NC组比较，P<0.01。图2 各组小鼠MBP和MOG蛋白表达水平

2.3 IL-33过表达促进髓鞘再生 TBI组小鼠脑组织LBP染色面积较sham组明显减少，IL-33组小LBP染色面积较NC组明显增加，而TBI组与NC组之间没有明显差异(见图3)。

A：Sham组；B：TBI组；C：NC组；IL-33组。图3 各组小鼠LBP染色比较

2.4 IL-33过表达治疗减轻了TBI大鼠的认知缺陷 在第28天的定位航行的实验中，与sham组相比，TBI组小鼠的逃避潜伏期显著延长(P=0.000)，与NC组相比，IL-33组的逃避潜伏期显著缩短(P=0.000)，而TBI组与NC组相比没有统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1 各组大鼠逃避潜伏期

3 讨论

TBI后轴突损伤和髓鞘膜的破坏通常会导致认知功能障碍，尽管TBI后炎症反应可以通过多种手段治疗，但目前尚无轴突修复和再生髓鞘的治疗方法[2]。研究表明IL-33参与人类多种神经系统疾病的炎症过程，如TBI、阿尔茨海默症、系统性硬化症、慢性神经痛、脑出血等[10-11]，且IL-33治疗能够起到神经保护作用[7,10]。而最新的研究表明组蛋白乙酰基转移酶抑制剂会诱导胶质细胞IL-33表达，起到促进髓鞘再生[5]。因此，本研究推测过表达IL-33治疗TBI可能改善轴突损伤及脱髓鞘反应。

在本研究的结果中发现，IL-33过表达增加了TBI小鼠脑组织中MBP 和MOG蛋白的表达，增加了脑组织LFB染色面积，说明IL-33过表达具有促进小鼠脑组织髓鞘再生的作用。此外，IL-33过表达还改善了TBI小鼠的认知功能与先前的研究结果一致[7]。但是，以前尚未报道IL-33过表达参与TBI后脑组织髓鞘再生。因此，本研究是首个阐明IL-33过表达通过促进髓鞘再生改善TBI小鼠认知功能缺陷的。

IL-33是属于IL-1家族的核细胞因子，在组织修复、免疫调节和炎症反应中起重要作用[11]。IL-33定位于细胞核，并通过一个常见的共色结合基序结合染色质[12]，在核转录中起调控功能，但尚未报道其与髓磷脂基因相关的核转录[13]。先前的研究表明IL-33在中枢神经系统特别是少突胶质细胞中高表达，在中枢神经系统损伤后起到免疫保护的作用[14]。同时有研究表明IL-33在中枢神经系统中具有神经修复作用，如在实验性变应性脑炎出现麻痹症状后给予IL-33可以降低其严重程度，而给予抗IL-33抗体会增加其严重程度[15]。而在脊髓损伤后体内给予IL-33可改善脊髓损伤区域的髓磷脂含量[13]。因此，这些研究表明外源性IL-33可能起到保护少突胶质细胞和修复髓鞘损伤的作用。本研究结果IL-33过表达可以直接影响MBP、MOG表达并促进髓鞘再生，进一步补充证实了内源性IL-33修复髓鞘损伤的作用。

内源性或外源性IL-33可以通过促进髓鞘修复，改善TBI小鼠学习记忆功能，为TBI后认知功能障碍提供了新的治疗前景。