王承霞，朱玉蓉

（江苏省肿瘤医院&江苏省肿瘤防治研究所&南京医科大学附属肿瘤医院检验科，南京 210009）

乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤，在我国乳腺癌的发病率和死亡率逐年攀升，占到所有女性癌症患者的15%，并以每年2.7%的比例快速增长，每年新增病例约278 800人，死亡人数约64 600人，严重危害人们的健康和生活[1-3]。因此，积极筛选乳腺癌诊断和预后的分子靶标，对提高乳腺癌检出率和治愈率具有重要意义[4-5]。

RNA组学如今成为研究热点，恶性肿瘤的研究从功能基因层面（编码蛋白质）逐渐拓展到非编码RNA领域，极大丰富人们对遗传信息调控网络的理解。研究表明，除编码蛋白基因外，超过基因组产物90%的非编码RNA，同样广泛参与细胞生长、发育等生命环节，在多个层面调控基因而发挥生物学功能[6]。研究发现一种由转运RNA（tRNAs）加工而成，来源于tRNA前体或成熟序列的小非编码RNA，即tRNA及其来源片段（tRNA-derived fragments）参与多种肿瘤的发生发展过程，成为与肿瘤相关的研究新热点[7-9]。然而这些来源于tRNA前体或成熟序列的小非编码RNA在乳腺癌中的研究鲜有报道。本文采用RT-PCR方法首次检测乳腺癌患者血清中tRF-32-Q99P9P9NH57SJ（tRF-32）的表达水平，并分析其表达水平与乳腺癌患者的临床病理资料的关系，初步探讨tRF-32的表达水平对乳腺癌的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2017年11月～2019年2月在江苏省肿瘤医院乳腺外科住院治疗的患者，其中乳腺癌患者51例（乳腺癌组），年龄29～76岁，平均年龄52.08±1.34岁，病例均经本院病理科确诊。临床分期：I期9例，II期18例，III期11例，IV期13例；30例有淋巴结转移，21例无淋巴结转移。所有患者均未行放、化疗等抗肿瘤治疗；体检后未见明显器质性疾病的女性25例为健康对照组，年龄28～69岁，平均年龄49.48±1.63岁，所有研究对象均抽取清晨空腹静脉血5 ml，静置30 min后，以3 000 r/min离心10 min，分离血清放置-80℃冻存待检。

1.2 试剂和仪器 ViiA 7 实时荧光定量PCR仪 (Applied Biosystems)，TRIzol LS 试 剂（life technologies，美国），rtStarTMtRF&tiRNA Pretreatment Kit (Cat#: AS-FS-005, Arraystar, MD, 美国)，rtStarTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit (3’ and 5’ adaptors) (Cat#: AS-FS-003, Arraystar, MD, 美 国) ，2X PCR master mix（Arraystar，MD, 美国）。

1.3 方法

1.3.1 总RNA的提取和纯度检测：从冰箱中取出血清样品，解冻后于4℃12 000×g离心10min，去除可能存在的杂质，取250μl血清，转至1.5ml的离心管中，加入750μl的TRIzol LS Reagent 试剂（invitrogen life technologies）和20μl冰醋酸采用Trizol法提取总RNA。纯度检测：紫外分光光度计检测总RNA纯度，A360mm/A280mm的比值0.82，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。

1.3.2 RNA前处理与cDNA合成：使用rtStarTMtRF&tiRNA Pretreatment Kit 试剂盒进行预处理，去除3’氨酰基末端与3’环磷酸末端，磷酸化5’羟基末端，并移去m1A, m3C等多种甲基化修饰。使用rtStarTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒进行接头连接和反转，合成cDNA第一链。

1.3.3 RT-PCR检测血清中tRF-32表达水平：以U6为内参，使用Primer Premier 5.0引物设计软件设计U6和tRF-32的引物序列：

反应条件：95℃10min；40个PCR循环[（95℃，10s；60℃，60s（收集荧光）]。所有样本设置3复孔，采用2-ΔCt方法计算血清中tRF-32的相对表达量。

1.4 统计学分析 采用SPSS20.0和GraphPad Prism v6.0统计学软件，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验。血清中tRF-32表达模式与临床病理参数的关系采用χ2检验。血清tRF-32在乳腺癌诊断中的诊断效能采用ROC曲线来评价。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌患者血清中tRF-32的表达分析 运用RT-PCR检测51例乳腺癌患者和25例健康对照者血清标本中tRF-32的表达量。tRF-32的扩增曲线和溶解曲线见图1，溶解曲线呈单峰。51例乳腺癌患者血清中tRF-32的表达量（13.84 ± 2.62）与25例健康对照组（39.47 ± 7.21）比较，差异具有统计学意义（t = 4.091, P ＜ 0.000 1）。结合临床病理特征分析，TNM分期中I-II期（n=27）的tRF-32表达量（16.97 ± 3.315）高于 III-IV 期（n=24）tRF-32表达量（7.07 ± 2.83），差异有统计学意义（t = 2.241, P = 0.029），同时无淋巴结转移（n=21）患者血清中的tRF-32表达量(18.75 ± 3.91)明显高于有淋巴结转移（n=30）患者血清中tRF-32表达量(7.80 ± 2.51)，差异有统计学意义（t = 2.47, P = 0.017）。

2.2 tRF-32与乳腺癌临床病理参数关系 见表1。分析上述51例乳腺癌患者血清中tRF-32的表达量与临床病理参数关系，根据血清中tRF-32表达量的中位数将患者分为高表达和低表达两组，采用卡方检验，发现tRF-32表达量与乳腺癌患者年龄无关（P＞0.05），而与TNM分期（χ2=8.463, P = 0.004）以及淋巴结转移（χ2=5.856, P = 0.016） 密切相关。

图1. tRF-32的扩增曲线和溶解曲线

表1 乳腺癌血清tRF-32的表达水平与临床参数的关系

2.3 ROC曲线分析 运用ROC曲线分析tRF-32对乳腺癌的诊断效能，见图2。血清中tRF-32诊断乳腺癌的ROC曲线AUC是0.776（95% CI: 0.673～0.880），敏感度和特异度分别为84.0 %和68.8%，以上提示血清tRF-32对评价乳腺癌有诊断意义。

图2 血清tRF-32诊断乳腺癌的ROC曲线分析

3 讨论

随着RNA-se q技术的广泛应用和分子生物学技术的快速发展，ncRNA领域的tRFs&tiRNAs引起广泛关注。目前认为，在特定条件下，tRNA发生切割，产生功能性小片段（tRNA-derived Frangments），主要包括tRNA的一半（tRNA-derived stress-induced RNAs; tiRNA）；tRNA衍生的片段（tRNA-derived fragments; tRFs）以及tRNA衍生的 小tRNA（tRNA-derived small RNAs；tsRNAs）[10]。近年来，更多的功能性小片段（tRNA-derived frangments）被发现，但对其功能研究只是庞大的tRFs&tiRNAs调控网络中的冰山一角，大量tRFs&tiRNAs的未知功能有待探讨[11-12]。因此，从tRFs&tiRNAs角度进一步挖掘乳腺癌新型分子靶标，将有助于揭示乳腺癌发生发展新机制，为临床诊疗提供新思路。

tRFs&tiRNAs通过类似于miRNA降解mRNA的作用机制，调控mRNA的稳定性，参与细胞增殖和细胞生长[11-12]。研究显示，tRFs&tiRNAs与YBX1结合，调控肿瘤基因转录本的稳定性，抑制肿瘤细胞的恶性进展，提示这类tRFs&tiRNAs是一类新的抑癌因子[13]。DHAHBI等[14]在小鼠血清中发现tiRNAs稳定性表达，具有转录前抑制功能，提示其可能是一类新型信号分子。

由于tRNA上存在大量的转录后修饰，而且tRNA需与氨基酸形成氨酰基tRNA方可参与蛋白翻译。当tRNAs被切割为tRFs&tiRNAs时，这些修饰（包括甲基化修饰、氨酰基末端修饰）会全部或部分的保留下来。tiRNAs常由RNA内切酶Angiogenin切割产生，这类内切酶会在切割位点产生5’羟基（5’-OH）末端与3’环磷酸（3’-cP）末端[15-16]。然而，5’端与3’端的接头连接步骤，需要底物小RNA 5’端为磷酸，3’端为羟基。此外，某些tRFs&tiRNAs的内部修饰比如m1A, m1G与m3C会严重阻碍反转录过程。因此为了准确检测tRFs&tiRNAs，这些修饰必须被有效的去除[17]。所以本课题在采用RT-PCR检测乳腺癌患者血清中tRF-32的表达水平之前，采用专门试剂盒对总RNA进行了去甲基化等前处理。

分析RT-PCR结果，我们发现与健康对照组相比，tRF-32在乳腺癌患者血清中低表达，并且其表达水平与乳腺癌临床分期以及淋巴结转移有关。血清中tRF-32表达程度越低，乳腺癌TNM分期越高，同时更容易发生转移。tRF-32用于乳腺癌诊断的敏感度为84.0 %，特异度为68.8%，对评价乳腺癌有一定的诊断价值。这些研究结果提示tRF-32在乳腺癌中低表达，可能发挥抑癌基因的作用，同时在乳腺癌中具有早期诊断和治疗的潜在价值。

本课题下一步计划是扩大血清样本量，收集更完整的临床资料，评价血清中tRF-32的临床价值。同时通过靶基因预测软件寻找tRF-32可能的靶基因，并在细胞水平和动物水平加以验证，探讨tRF-32在乳腺癌恶性进展中发挥的作用，为确定tRF-32成为肿瘤诊断和治疗的生物学指标提供实验基础。